HPLC法同时测定小儿热速清颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量

史宏妍，潘成学（1.河南省中医院，郑州450003；2.郑州大学药学院，郑州450001）

小儿热速清颗粒由黄芩、金银花、柴胡、板蓝根、葛根等多味中药材组成，具有清热解毒、泻火利咽的功效[1]，对小儿急性呼吸道感染疗效显著[2]。黄芩是处方中的君药，其有效成分黄芩苷具有多种生物活性，绿原酸是金银花的主要有效成分，也是质量控制的主要指标之一。为进一步完善该制剂的质量控制方法，笔者采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定该制剂中绿原酸和黄芩苷的含量，方法简便易行，结果准确可靠，可用于该制剂的质量控制。

1 仪器与试药

LC-10 A型HPLC仪，包括LC-10 ATVP泵，SPD-10 AVP紫外检测器（日本SHIMADZU公司）；色谱工作站：HW-2000（南京千谱软件有限公司）；BP211 D型1/10万电子分析天平（德国Sartorius公司）。

绿原酸、黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110753-200413、110715-200514，供含量测定用）；小儿热速清颗粒（哈尔滨圣泰制药有限公司，批号：1104062、1105087、1106029，规格：每袋2 g）；甲醇为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品和黄芩苷对照品适量，加甲醇溶解，超声15 min，用甲醇分别制备成绿原酸浓度为0.15mg·mL－1和黄芩苷浓度为0.30mg·mL－1的溶液，作为对照品贮备液[3]。

2.1.2 供试品溶液的制备 取小儿热速清颗粒10 g，研细，精密称取约2 g，置于50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，超声处理15min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.1.3 阴性对照液的制备 按处方制备缺金银花提取物、黄芩提取物的阴性样品，按“2.1.2”项下方法处理，即得。

2.2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：DiamonsilTM-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-磷酸（v/v＝52∶48∶0.1），pH：4.0；流速：1 mL·min－1；进样量：10 μL；检测波长：323 nm；柱温：25℃。分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液10 μL，注入色谱仪。理论板数以绿原酸、黄芩苷分别计算，应不低于2400、4700。绿原酸、黄芩苷的拖尾因子分别为1.01、1.03，保留时间约为4.5、22.5 min；绿原酸、黄芩苷及与其他组分的分离度都＞1.6；阴性样品不干扰样品测定。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.3 线性关系考察

分别精密量取一定量的绿原酸和黄芩苷对照品贮备液，加流动相稀释成绿原酸浓度为1.50、8.5、15.00、22.50、30.00、35.50、40.00 μg·mL－1的溶液；黄芩苷浓度为0.5、5、25、50、75、100 μg·mL－1的溶液。按照“2.2”项下色谱条件依次进样。以浓度（X，μg·mL－1）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得绿原酸回归方程Y＝2081.51675 X+3.67132（r＝0.9996，n＝6）；得黄芩苷回归方程Y＝25.142 X+1.3674（r＝0.9999，n＝6）。结果表明，绿原酸检测浓度在1.50～40.00 μg·mL－1之间、黄芩苷检测浓度在0.50～100.00 μg·mL－1之间与峰面积积分值线性关系良好。

2.4 精密度试验

分别精密吸取绿原酸和黄芩苷对照品贮备液适量，重复进样6次，每次10 μL，按“2.2”项下色谱条件操作，测定峰面积[4]。结果，绿原酸RSD＝1.36%（n＝6），黄芩苷RSD＝0.94%（n＝6），表明仪器精密度较好。

2.5 重复性试验

分别精密量取同一批样品适量，共5份，分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液，并进行色谱分析。结果，绿原酸RSD＝1.62%，黄芩苷RSD＝1.20%，表明方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

分别精密量取供试品溶液10μL，分别于0、1、2、4、6、8、12、24h进样，测定。结果，绿原酸RSD＝1.53%，黄芩苷RSD＝0.38%，表明供试品溶液24 h内基本稳定。

2.7 加样回收率试验

精密称取同一批号样品（批号：1104062）适量，共5份，加入相应量的绿原酸和黄芩苷对照品，按“2.1.2”项下方法处理并测定，计算回收率。结果，绿原酸平均加样回收率为99.22%，RSD＝1.45%；黄芩苷平均加样回收率99.68%，RSD＝0.84%，详见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝5）Tab 1 Results of recovery tests（n＝5）

2.8 样品含量测定

取一定量3批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，取10 μL进样，按“2.1”项下方法分别测定样品中绿原酸和黄芩苷的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

3 讨论

小儿热速清颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量各不相同，黄芩苷的测定与2005年版《中国药典》方法进行比较[5]，两种方法测定结果非常吻合，但该药典方法只能单一测定黄芩苷的含量，不能同时测定黄芩苷和绿原酸的含量。为了保证其质量，选择一种简便、快速、准确的定量方法控制其质量是非常重要和必要的。

在流动相系统的选择中，笔者曾以甲醇-水-磷酸、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-磷酸、乙腈-水-冰醋酸等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行等度和梯度洗脱试验。结果表明，用甲醇-水-磷酸（52∶48∶0.1）进行梯度洗脱为佳，峰形对称且分离度较好，调整流动相不同时间洗脱比例之后，各峰的保留时间适中，且基线较平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的肩峰、拖尾现象等。

[1]国家药典委员会.国家药品标准新药转正标准（第38册）[S].北京：人民卫生出版社，2004：38-21.

[2]徐新红，王素翠，贾 曦.小儿热速清颗粒的临床治疗与护理观察[J].光明中医，2008，23（8）：1201.

[3]李 坚，冯焕村，杜 璐.HPLC法测定银黄含片中绿原酸和黄芩苷的含量[J].广东药学院学报，2005，21（6）：683.

[4]张海珠，周 浓，李海峰，等.HPLC法测定小儿热速清颗粒中黄芩苷的含量[J].亚太传统医药，2009，5（8）：52.

[5]周 浓，王 胤，谢 静，等.对2005年版《中国药典》小儿热速清口服液中含量测定方法的改进[J].中国药房，2010，21（27）：2559.