色满卡林对培养乳鼠心肌细胞H／R损伤的保护作用研究

祝春梅，王国贤，张 涛

（1.辽宁医学院附属第一医院，2.辽宁医学院药理学教研室，辽宁 锦 州121000）

色满卡林（CRK）是传统的钾通道开放剂，具有舒张血管、降低血压、保护心脏的作用，用于高血压和心肌缺血的治疗，但其作用机制尚未完全阐明［1－3］。本研究在建立原代培养大鼠乳鼠心肌细胞H／R损伤模型的基础上，观察CRK对受损心肌细胞的保护作用，并对其作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：选用出生2－3 d的SD大鼠乳鼠，雌雄不拘，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（辽）2003－0008。主要设备：CO2孵育箱、全自动生化分析仪、倒置显微镜、79－1磁力加热搅拌器、JY2型超声细胞粉碎仪、721紫外分光光度计、流式细胞仪。主要试剂：CRK（Sigma）、DMEM 培养基（Gibco）、新生牛血清（北京华美生物工程公司）、LDH检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）、Annexin V－FITC凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司）、Caspase－3抗体（Cell Signaling公司），其余试剂均为国产分析纯。

1.2 心肌细胞分离培养 取出生2－3 d的SD大鼠乳鼠，无菌条件下，开胸剪取心脏，剪成1 mm3的小块后用0.08%胰蛋白酶消化液消化10 min，重复以上过程4－6次，1 000 r／min离心10 min后弃上清，加入含15%小牛血清的DMEM培养基混悬沉淀的细胞，置入CO2孵箱，37℃条件下培养2 h，以差速贴壁分离法纯化心肌细胞。调整细胞浓度至1×106个／ml，接种到培养瓶内，常规培养，第三天加药。

1.3 心肌细胞H／R损伤模型的制备 缺氧：将细胞置入37℃、95%N2＋5%CO2饱和的细胞培养箱培养2 h；复氧：将细胞置入37℃、5%CO2饱和的细胞培养箱中继续培养30 min。

1.4 实验分组 将常规培养3 d的心肌细胞分为5组：①正常对照组：细胞正常培养，不施加任何处理因素；②H／R组：缺氧2 h，复氧30 min；③用药组：三组中分别加入终浓度为2.5、5、10μmol／L的CRK，即刻缺氧2 h，复氧30 min。

1.5 细胞培养液中LDH活性测定 收集各组细胞培养液，用LDH试剂盒并按其说明书进行操作，各种液体加好后，用721紫外分光光度计测各组液体的吸光光度值（检测波长440 nm），用公式计算出LDH的释放量，检测LDH的活性。

1.6 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率 各组细胞先用0.125%胰蛋白酶消化细胞，调整细胞浓度至1×106个／ml，离心并弃上清；加入预冷的PBS震荡重悬，离心去上清。加入含10μl Annexin V－FITC和5μl PI的Binding Buffer 200μl，混匀后室温避光反应15 min，再加入Binding Buffer 300μl上机检测。

1.7 Western blot分析caspase－3蛋白表达水平

心肌细胞给予各组药物处理培养后，用细胞刮刀刮下细胞，用PBS洗两遍，离心，弃上清，将心肌细胞放置于－70℃冰箱中备用，测定指标时取出样品，每份样品取样50μg，变性的SDS－聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳，电压积压80 V，分离胶120 V，半干法将蛋白转移至硝酸纤维素膜，恒压电泳95 V，室温1 h，4℃封闭过夜，按0.1 ml·cm－2膜面积加入1∶2 000稀释的一抗 （兔抗 Caspase－3，购自 Cell Signaling公司）杂交2 h，封闭液漂洗后按0.1 ml·cm－2膜面积加入1∶2 000稀释的二抗 （鼠抗兔IgG抗体，购自北京中山金桥生物有限公司），室温下摇床杂交1 h，漂洗后加显色剂 （NBT，购自沈阳基因公司）5 min，放射显影。

1.8 统计学分析 数据采用SPSS 13.0软件完成统计处理分析。所有计量资料结果采用表示，组间比较采用单因素方差分析和LSD－t检验。以P≤0.05为差异具有显著性，P≤0.01为差异具有非常显著性。

2 结果

2.1 各组细胞培养液中LDH活性测定 见表1。

表1 细胞培养液中LDH活性测定（）

表1 细胞培养液中LDH活性测定（）

注：与正常对照组比较，＊P＜0.01；与损伤组比较，△P＜0.01

组别 LDH（U／L）80.7±9.8 H／R组 176.9±15.5＊CRK低剂量组 144.7±7.0△CRK中剂量组 109.8±16.4△CRK高剂量组 90.3±5.4正常对照组△

H／R组培养液中LDH活性较正常对照组明显升高。CRK各浓度组培养液中LDH活性较H／R组低，CRK低、中、高剂量组LDH细胞漏出较H／R组分别降低33.47%、69.75%和90.02%，以高剂量组最为明显。

2.2 各组心肌细胞凋亡率 见表2，图1。

注：与正常对照组比较，＊P＜0.01；与损伤组比较，△P＜0.01

2.3 各组心肌细胞caspase－3活性蛋白表达水平见表3，图2。

表3 各组心肌细胞caspase－3活性蛋白表达水平的比较（）

表3 各组心肌细胞caspase－3活性蛋白表达水平的比较（）

注：与正常对照组比较，＊P＜0.01；与损伤组比较，△P＜0.01

0.71±0.07 H／R组 1.61±0.08＊CRK低剂量组 1.23±0.06△CRK中剂量组 0.97±0.08△CRK高剂量组 0.77±0.05组别 蛋白灰度比值正常对照组△

经 Western blot分析显示，正常对照组培养乳鼠心肌细胞Caspase－3 17 k D亚单位的表达量很小，灰度值为0.71±0.07；经 H／R处理的组别出现17 k D带谱，表达量明显高于正常对照组（P＜0.01）；而CRK组的Caspase－3 17 k D亚单位表达量低于H／R组（P＜0.01）。

图1 各组心肌细胞凋亡率比较

图2 各组心肌细胞caspase－3活性蛋白表达水平的比较

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤主要是由于心肌细胞缺血缺氧，活性氧生成增多，破坏了机体氧化－还原动态平衡。而心肌细胞凋亡是持续性心肌缺血中早期心肌细胞死亡的主要形式，再灌注促进了细胞的不可逆损伤［4］。

细胞凋亡早期改变主要表现为磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，通过PS特异的Annexin V，联合细胞活性鉴定染料PI双染，对细胞生存状态进行定性和定量分析；同时心肌细胞培养液中LDH的活性是观察H／R损伤的重要指标，反映损伤对细胞膜通透性的影响［5］。将两项指标结合起来，对细胞膜完整性及稳定性进行研究。本研究利用95%N2＋5%CO2条件使心肌细胞缺氧培养2 h，再复氧，结果显示培养基中LDH漏出明显，细胞凋亡率及凋亡蛋白表达增加，证实H／R模型制备成功。而经CRK预处理的心肌细胞，则可不同程度地降低以上损害。说明CRK可以维持心肌细胞膜的完整性及稳定性，从而减轻心肌细胞损伤。

CRK是传统的ATP敏感性钾通道开放剂，临床用于高血压和心肌缺血的治疗［6］。已有研究显示，线粒体ATP敏感性钾通道（Mito－KATP）开放后可以显著降低氧应激诱发的心肌细胞凋亡的发生率［7］。可能为缺血再灌注早期大量氧自由基产生，开放 Mito－KATP，稳定线粒体跨膜电位（Δψm），减少线粒体内膜的通透性转换孔（MPTP）开放及细胞凋亡的蛋白质释放，从而减少心肌细胞的凋亡［8－10］。这与本研究得出的结论一致。标志性凋亡蛋白酶caspase－3在细胞即将发生凋亡时会由无活性酶原状态裂解成由17k D和12 k D两个亚单位组成的异源二聚体，通过级联反应最终引起细胞凋亡［11］。本研究结果显示：体外原代培养的乳鼠心肌细胞经H／R处理后，caspase－3蛋白活性表达上调，而CRK预处理的心肌细胞，可逆转如上变化，提示CRK对心肌细胞具有保护作用，可以减少caspase－3酶原活化，对心肌细胞凋亡具有抑制作用。综上，CRK对缺氧复氧致培养大鼠乳鼠心肌细胞的损伤具有保护作用，其机制可能与CRK维持细胞膜完整性与稳定性，下调caspase－3活性蛋白表达水平，降低心肌细胞凋亡有关。

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