维康醇对DNA拓扑异构酶活性的影响

历文，尹晓慧，段丽丽，陈杰鹏，周雪莹，朱晓琳，牛哲峰，张美侠

（1.中国医科大学药学院临床药理教研室，沈阳 110001；2.齐鲁制药有限公司研发部，济南 250100；3.广东汕头保税区双骏生物科技有限公司应用生物技术研究所，广东 汕头 515071）

紫杉烷类的代表药物紫杉醇（paclitaxel，PTX）是从紫杉树树皮中提取的一种天然植物类抗肿瘤药物。研究证实，PTX是乳腺癌、卵巢癌及非小细胞肺癌的一线和二线治疗药物，并可用于治疗头颈癌、食管癌、精原细胞瘤和复发性非霍奇金淋巴瘤等［1～5］。维康醇是利用高产PTX菌种发酵生产的新型单体化合物，本实验室前期研究结果证实：维康醇对肝癌、胰腺癌、卵巢癌等多种肿瘤细胞株具有增殖抑制作用，可引起细胞周期阻滞并诱导细胞自噬和凋亡，但其具体的作用靶点尚不清楚。DNA拓扑异构酶（topoisomerase）参与DNA复制、转录、重组及修复等所有关键的细胞核内过程，是抗肿瘤研究的热点。本研究拟探讨维康醇对DNA拓扑异构酶活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

pBR322 DNA（产品号：D3050）、DNA 拓扑异构酶 Ⅰ（TopoⅠ）（产品号：D2240A）、ATP、（产品号：D4041）购自TaKaRa公司；DNA拓扑异构酶Ⅱα（TopoⅡα）（产品号：T8944-100UN） 购自 Sigma公司；10-羟基喜树碱 （10-hydroxy camptothecin，10-HCPT）由沈阳药科大学提供；依托泊苷（产品号：105007HN）购自山东齐鲁药业有限公司；溴化乙锭（ethidium bromide，EB）购自 Amresco公司；维康醇由广东汕头保税区双骏生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 TopoⅠ介导的解旋作用及药物的影响：反应体系：pBR322 DNA 0.5 μg，DNA TopoⅠbuffer 2 μL，DNA TopoⅠ1 U（1 U定义为在37℃、30 min内把0.5 μg/50 μL 的 supercoiled pBR322 DNA 转换成100%的松散型酶的活性），0.1%BSA 2 μL，不同浓度（1，5，50 mmol/L）维康醇溶液 2 μL（实验组）或不同浓度（5，50 mmol/L）10-HCPT 2 μL（阳性对照组），灭菌蒸馏水补足至20 μL。37℃反应30 min，加入5 μL的5×反应终止液（0.74%EDTA，50%丙三醇，0.1%溴酚蓝显色液）终止反应。在TAE缓冲液中行0.8%琼脂糖凝胶电泳40 min（电压50 V）。电泳结束后 EB（0.5 μg/mL）染色 30 min，应用 Tanon Gls凝胶图像分析系统软件在紫外灯下对电泳凝胶图像进行观察并拍照分析。实验重复3次。

1.2.2 琼脂糖凝胶电泳法测定TopoⅡ的活性及药物的影响：10×反应缓冲液（pH8.0 0.5 mol/L Tris-HCl，1.2 mol/L KCl，5 mmol/L DTT，0.1 mol/L MgCl2，5 mmol/L ATP） 2 μL，50 μg/mL BSA 1 μL，pBR322 DNA 0.5 μg，DNA TopoⅡ2 U，及不同浓度的维康醇溶液 2 μL（实验组）或依托泊苷溶液 2 μL（阳性对照组），灭菌蒸馏水补足至 20 μL。37℃反应30 min，加入5 μL的5×反应终止液终止反应，在TAE缓冲液中行0.8%琼脂糖凝胶电泳40 min（电压50 V）。电泳结束后 EB（0.5 μg/mL）染色 30 min，应用 Tanon Gls凝胶图像分析系统软件在紫外灯下观察电泳凝胶图像并拍照分析。实验重复3次。

2 结果

2.1 维康醇对TopoⅠ介导的解旋作用的影响

TopoⅠ切断DNA双链中的1股，使DNA双链在解链旋转中不致打结，适当时候再把切口封闭，使DNA变为松弛状态，从而可催化超螺旋的DNA松弛解旋。利用TopoⅠ介导的负超螺旋pBR322 DNA解旋作用，观察维康醇对TopoⅠ活性的影响。结果如图 1所示：超螺旋 DNA（pBR322 DNA，lane D）在TopoⅠ作用下解旋呈松散型DNA（lane T），随着阳性对照药物10-HCPT浓度的升高，抑制了TopoⅠ介导的对pBR322 DNA的解旋作用（lane E），不同浓度的维康醇对TopoⅠ介导的pBR322 DNA解旋无明显影响（lane Alternol）。

2.2 维康醇对TopoⅡ介导的解旋作用的影响

如图2所示：超螺旋DNA（pBR322 DNA，lane D）在TopoⅡ作用下解旋呈松散型DNA（lane T），不同浓度的阳性对照药物依托泊苷均对TopoⅡ介导的pBR322 DNA解旋有抑制作用（lane E），不同浓度的维康醇对TopoⅡ介导的pBR322 DNA解旋有明显抑制作用，在浓度达到5 μmol/L时抑制作用与依托泊苷5 μmol/L时的抑制作用相近（lane Alternol）。

3 讨论

DNA拓扑异构酶是广泛存在于真核和原核生物体内的基本酶之一，参与DNA复制、转录、重组及修复等所有关键的细胞核内过程，在细胞生命过程中起重要作用。TopoⅠ通过调节超螺旋、连锁、去连锁以及核酸解结作用，影响DNA拓扑结构［6］；TopoⅡ在肿瘤细胞中的含量及活性远远高于正常细胞，通过调节核酸结构动态变化，在DNA复制完成后使相互交联的姐妹染色体分开，与肿瘤的发生、发展以及防治等有密切关系。由于DNA超螺旋程度影响着机体的活动，而拓扑异构酶的作用正是控制DNA的空间构型酶，因此，该酶被列为筛选抗肿瘤药物的重要靶酶［7～9］。

从天然药物中筛选高效低毒的抗肿瘤药物是获取抗肿瘤药物的重要策略。本实验室的前期研究结果表明：维康醇有抑制肝癌细胞增殖、引起细胞周期阻滞和诱导细胞自噬和凋亡的作用。本研究以DNA拓扑异构酶为靶点探讨维康醇对DNA拓扑异构酶活性的影响，分别采用1 U TopoⅠ和2 U TopoⅡ的反应体系进行研究（经实验表明，1 U TopoⅡ的反应体系对DNA的解旋作用效果并不明显，因此选用2 U TopoⅡ的反应体系进行实验）。本研究结果表明：维康醇能明显抑制TopoⅡ的活性，抑制其介导的DNA解旋或断裂，但对TopoⅠ的活性几乎无影响，因此我们推测维康醇对肿瘤细胞的抑制作用可能与其抑制TopoⅡ的活性有关，TopoⅡ可能是其抗肿瘤作用的细胞内靶点之一，且维康醇对TopoⅡ的抑制作用与同浓度阳性对照药依托泊苷相似，未来有可能成为TopoⅡ抑制剂依托泊苷的代替品。因此，维康醇是值得关注的抗肿瘤药物。拓扑异构酶抑制剂按药物作用方式可分为拓扑异构酶毒剂和拓扑异构酶阻遏剂；按药物与DNA的结合方式可分为DNA嵌入剂和DNA非嵌入剂。关于维康醇具体属于哪一种拓扑异构酶抑制剂仍有待进一步研究确认［10，11］。

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