应用组织芯片技术检测结直肠癌组织中KAI1/CD82和ME491/CD63的表达

季润元，史恩溢，王永实，李小宁，赵玉芳，冯振卿

（1.江苏省淮阴卫生高等职业技术学校，淮安市消化道肿瘤重点实验室，江苏 淮安 223300；2.江苏省苏州卫生职业技术学院病理教研室，江苏 苏州 215009；3.江苏省淮安市肿瘤医院病理科，江苏 淮安 223200；4.南京医科大学病理学系，南京 210029）

跨膜4超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）是结构上属于细胞膜糖蛋白的特殊家族，该家族中有 5个成员即 MRP1/CD9、ME491/CD63、KAI1/CD82、CD151和CD81，与细胞的运动、增殖和肿瘤细胞的转移有关［1］。KAI1（kang ai 1）基因是美籍华人DONG于1995年发现的肿瘤转移抑制基因［2］，KAI1基因对绝大多数肿瘤的转移起抑制作用，与肿瘤的侵袭力、预后明显相关。KAI1编码区编码267个氨基酸残基、分子量为29.6 kDa的蛋白质，与已发现的CD82结构相同。CD82是一种白细胞表面糖蛋白，属于跨膜4超家族（TM4SF）成员［3］。黑色素瘤相关抗原ME491（melanoma associated antigen ME491）在肿瘤早期进展过程中高度表达。CD63最初报道与血小板激活有关，是一种溶酶体糖蛋白，存在于多种类型细胞表面，研究最多的是在人黑色素瘤细胞中的表达。序列分析发现ME491和CD63是相同的。KAI1/CD82、ME491/CD63属于跨膜4超家族（TM4SF）成员，目前认为与肿瘤转移有关［4］。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集江苏省淮安市肿瘤医院2005-2010年结直肠癌手术切除标本232例，男性119例（51.3%），女性113例（48.7%）。结直肠癌的诊断标准按WHO肠道肿瘤组织学分型进行，所有样本切片均经组织病理学证实。病理分型均为腺癌，其中高分化34例，中分化154例，低分化44例。Dukes分期：A期10例、B期127例、C期73例、D期22例。所有患者均无肠癌家族遗传史，术前均未接受过放化疗。

1.2 组织芯片构建

所有病例的肿瘤组织标本均经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片。依据HE切片确定具有代表性的病变部位，应用自有专利技术（专利号200920350099.2）组织芯片构建仪制备组织芯片。主要步骤如下：用构建仪在选取的组织蜡块中穿取组织，直径1.5 mm。应用自有的组织芯片制备系统（包括组织芯片包埋底模、组织芯片胶、组织芯片阵列模、一次性加取样针及其配套使用的针芯和针帽、定位冷却器以及植芯器等组成部分）依次按序操作，成功制成含有232例结直肠癌的组织芯片蜡块，每个病例均含有2个原发灶肿瘤组织。用德国LEICA石蜡切片机进行连续切片，厚度为4 μm。

1.2 主要试剂

鼠抗人KAI1/CD82购自美国Santa Cruz公司，鼠抗人ME491/CD63单克隆抗体购自美国Thermo公司，MaxVision试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒等试剂购自福州迈新公司。

1.3 方法

KAI1/CD82和ME491/CD63染色方法为MaxVison两步法，严格按照MaxVision染色试剂盒中说明书进行操作。KAI1/CD82和ME491/CD63工作浓度为1∶50。结直肠癌组织芯片常规脱蜡水化，加一抗之前1 mmol/L EDTA（pH 8.0）水浴修复20 min。而后加一抗4℃冰箱过夜，第2天切片恢复室温后，加MaxVision二抗温箱培育30 min，DAB显色，苏木精衬染。以PBS代替一抗作阴性对照。细胞膜和（或）细胞质内含棕褐色颗粒者为KAI1/CD82和ME491/CD63阳性细胞。按阳性细胞占镜下肿瘤细胞的百分比将阳性强度分为4个等级，分别是无阳性细胞为（-），阳性细胞占<25%为（+），25%～50%为（++），>50%为（+++），（-）～（+）记为阴性，（++）～（+++）记为阳性。

1.4 统计学处理

将所有实验数据输入SPSS 13.0统计软件包，KAI1/CD82和ME491/CD63表达与结直肠癌临床病理因素之间的相互关系应用χ2检验，KAI1/CD82和ME491/CD63表达之间的相关性检验采用Spearman相关分析。以α=0.05作为检验标准。

2 结果

2.1 结直肠癌组织芯片

464个组织点阵排列整齐，HE、免疫组化染色均匀，无掉片、脱片、扭曲和重叠现象。

2.2 KAI1/CD82和ME491/CD63在结直肠癌组织中表达情况

KAI1/CD82和ME491/CD63免疫组化阳性反应产物均主要定位于细胞质和（或）细胞膜（图1，图2）。KAI1/CD82阳性者117例，阴性者115例，阳性表达率为50.4%。ME491/CD63阳性者204例，阴性者28例，阳性表达率为87.9%。

2.3 KAI1/CD82和ME491/CD63表达与结直肠癌临床病理特征的关系

KAI1/CD82的表达与结直肠癌的分化程度和Dukes分期差异有统计学意义，KAI1/CD82在中-高分化、Dukes A+B+C期结直肠癌的阳性表达率显著高于低分化、Dukes D期结直肠癌（53.7%vs 36.4%，P＜0.05；52.9%vs 27.3%，P＜0.05，表 1），而与患者的性别、年龄及癌组织浸润深度、淋巴结转移差异无统计学意义（P＞0.05，表1）；ME491/CD63的表达与患者的性别、年龄及癌组织浸润深度、分化程度、淋巴结转移和Dukes分期差异无统计学意义（P＞0.05，表 1）。

表1 KAI1/CD82和ME491/CD63表达与结直肠癌临床病理特征的关系Tab.1 Relationships between the expression ofKAI1/CD82，ME491/CD63 and their clinicopathological characteristic in colorectal carcinoma

2.4 MRP1/CD9和ME491/CD63在结直肠癌组织中的表达关系

本研究对KAI1/CD82和ME491/CD63的表达进行Spearman相关分析。结果表明，232例结直肠癌组织标本中，KAI1/CD82和ME491/CD63在结直肠癌中的表达呈显著正相关（r=0.136，P＜0.05）。

3 讨论

KAI1/CD82在其抑制肿瘤转移作用发现之前，是作为一种白细胞膜糖蛋白被认识的。Dong等［2］将KAI1cDNA转染高转移的鼠黑色素瘤细胞系，结果发现表达KAI1的克隆吞噬能力及侵袭能力均下降，而且这些改变均呈剂量效应关系。表达KAI1的克隆细胞在裸鼠肺内形成的转移克隆数也较亲代明显减少。这些都说明KAI1/CD82具有直接的抑制肿瘤转移作用。KAI1/CD82的表达缺失或下调已经在多种恶性肿瘤中发现，如肺癌［3］、胃癌［4］、胰腺癌［5］、乳腺癌［6］、膀胱癌［7］等。本研究发现，KAI1/CD82 在低分化结直肠癌组织中的表达显著低于高分化癌组织，且Dukes D期癌组织中KAI1/CD82的表达低于Dukes A、B、C期癌组织。说明分化越差、恶性程度越高的结直肠癌细胞，KAI1/CD82蛋白表达缺失的越多。

本研究显示结直肠癌中KAI1/CD82的表达与患者的性别、年龄、肿瘤浸润深度、淋巴结转移均无关（P>0.05）。其中，研究结果所显示的结直肠癌中KAI1/CD82的表达与淋巴结转移无关，这不同于国内外绝大部分研究的结论。目前国内外的研究均认为KAI1/CD82是肿瘤转移的抑制基因，肿瘤发生淋巴结转移时表达下调。作者以前在食管癌［8］和胃癌［9］中的研究，也认为KAI1是肿瘤转移的抑制基因。本研究尝试用KAI1/CD82表达阳性细胞数不同百分比作为分组标准，均得出相同的结论，KAI1/CD82的表达与淋巴结转移无关。Dukes A、B和Dukes C、D比较同样没有显著性差别。但Dukes D期癌组织中KAI1/CD82的表达低于Dukes A、B、C期癌组织，我们可以认为，当结直肠癌进展到Dukes D期才出现KAI1/CD82的表达下调。在样本数量较大、实验判断精确的情况下，为什么会得出这样与其他实验不同的结论，值得进一步探讨。

黑色素瘤相关抗原ME491（melanoma associated antigen ME491）在肿瘤早期进展过程中高度表达。以人重复Alu序列为探针从λ基因文库筛选、通过DNA介导的基因转导方法克隆出ME491基因。ME491抗原由237个氨基酸组成，有4个跨膜区，3个N-糖基化点［11］。关于ME491/CD63研究最多的是在人黑色素瘤细胞中的表达。ME491/CD63在黑色素瘤早期阶段表现为高表达，但在正常黑色素细胞中不表达，在黑色素瘤进展阶段和转移性黑色素瘤中低表达或不表达。ME491/CD63的表达与其他恶性肿瘤关系的研究，目前已见报道的有乳腺癌、非小细胞性肺癌、角质上皮癌、胰腺癌［11］，上述恶性肿瘤均表达ME491/CD63，但未发现ME491/CD63的表达与肿瘤的分级、转移、预后有关。也有研究认为ME491/CD63表达与肿瘤进展有关［4］。在本研究中，未能证明ME491/CD63表达与结直肠癌转移、分级、浸润深度、Dukes分期有相关性（P＞0.05）。

本研究的结果亦显示KAI1/CD82和ME491/CD63的表达呈显著相关性，未见文献报道。对KAI1/CD82和ME491/CD63及他们与肿瘤相关性的深入研究，将有助于我们进一步揭示肿瘤的转移机制，找到抑制肿瘤转移的靶点或预测肿瘤患者预后的指标。

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