不同固定液对胃癌细胞骨架及连接蛋白荧光染色标记效果的比较

高建，郑倩倩，李彦姝，周末

（中国医科大学 1.实验技术中心三部；2.基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001）

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，肿瘤细胞的侵袭和转移是恶性肿瘤的主要表现，也是导致进展期胃癌预后差的根本原因。上皮间质化在上皮来源的恶性肿瘤侵袭转移过程发挥重要作用。细胞骨架的形态、结构、功能以及病理变化成为研究热点［1～3］。近期研究报道，细胞骨架结构改变与上皮间质化发生相关［4，5］，上皮间质化发生后可使某些细胞间连接蛋白表达缺失或错误定位。微丝对细胞黏附、铺展、运动、内吞、分裂具有重要调节作用。通过预染微丝来反映细胞骨架变化，已经成为人们研究细胞形态变化、肿瘤侵袭迁移的重要手段。本实验主要采用激光共聚焦扫描显微镜观察3种固定液对SGC-7901胃癌细胞的微丝和细胞连接蛋白Zo-1的影响，探讨不同固定液对细胞骨架和连接蛋白固定效果，选择最佳固定方法，为进一步研究胃肠肿瘤侵袭、转移过程中细胞骨架结构改变及细胞间连接蛋白表达缺失或错误定位提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

胃癌细胞系SGC-7901为我校细胞生物学教研室保存。胎牛血清、DMEM高糖培养基，购自美国Gibco公司；Triton X-100，购自日本TaKaRa公司；BSA、FITC-Phalloidin、DAPI，购自美国 Sigma 公司；Zo-1-FITC，购自美国Invitrogen公司。激光共聚焦显微镜（FV-1000），购自日本OLYMPUS公司；二氧化碳培养箱，购自美国Thermo公司。

1.2 SGC-7901细胞培养

SGC-7901细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，于37℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期的细胞用胰酶消化成单个，调整细胞浓度为1×105/mL和1×106/mL，分别接种于含盖玻片的12孔板，培养12 h后细胞贴壁生长。

1.3 激光共聚焦扫描显微镜观察SGC-7901细胞在不同固定液处理下的微丝和连接蛋白

2种密度的细胞均分别用4℃预冷的4%多聚甲醛、2.5%戊二醛和95%乙醇室温固定20 min，PBS冲洗3次，每次10 min。5%BSA（含0.2%Triton X-100）封闭透膜1 h。PBS冲洗3次，每次5 min。加入FITC-Phalloidin抗体于低密度细胞，室温避光孵育1 h。Zo-1-FITC抗体加到高密度细胞，室温避光孵育1 h。PBS冲洗3次，每次10 min。DAPI染核，室温孵育15 min。PBS冲洗3次，每次10 min。60%甘油封片，用OLYMPUS FV1000激光共聚焦扫描显微镜进行扫描，激发光波长为488 nm。

2 结果

2.1 用4%多聚甲醛固定的SGC-7901细胞骨架形态

4%多聚甲醛固定细胞进行荧光标记后发现，微丝结构完整，呈细丝拉网状，层次清晰，有较强的立体感，胞质及胞核区干净无非特异染色（图1B）。与细胞核图像融合后发现2种荧光无窜色现象（图1C）。

2.2 用2.5%戊二醛固定的SGC-7901细胞骨架形态

用2.5%戊二醛固定细胞后，细胞微丝结构基本完整，在细胞的外周胞膜处可观察到较完整的网络体系，而细胞内部微丝荧光染色标记效果模糊，部分以高信号点状结构出现在胞质及胞核周围，不易分辨出清晰的网状结构（图2B）。叠加图像亦清晰，无窜色现象（图2C）。

2.3 用95%乙醇固定的SGC-7901细胞骨架形态观察

细胞经过95%乙醇固定后形态欠规整，细胞外周微丝骨架结构略模糊。微丝纤维之间的区分不明显，排列较乱，出现了类似核仁定位的绿色荧光信号非特异性高表达（图3B）。

2.4 用4%多聚甲醛固定的SGC-7901细胞间连接蛋白形态

使用4%多聚甲醛固定处理细胞后，可观察到细胞密集区出现Zo-1绿色荧光信号高表达，定位于邻近细胞紧密连接处，细胞核区中空，细胞质见低表达的荧光信号（图4B），叠加图像可见Zo-1定位清晰，叠加染色无变化（图4C）。

2.5 用2.5%戊二醛固定的SGC-7901细胞间连接蛋白形态

使用2.5%戊二醛固定细胞后，选择细胞密集区域进行图像采集，发现细胞质呈均一性非特异高信号荧光染色，核区亦出现了类似核仁结构的绿色荧光信号高表达（图5B）。叠加图像无特异性Zo-1定位，且出现共定位现象，叠加颜色变成青绿色（图5C）。

2.6 用95%乙醇固定的SGC-7901细胞间连接蛋白形态

用95%乙醇固定细胞后进行激光共聚焦扫描显微镜采图，荧光标记效果介于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛之间。可以观察到较为明显的Zo-1表达及定位于细胞间紧密连接，但胞质和胞核区呈现略强的弥漫性非特异荧光信号（图6B）。

3 讨论

激光共聚焦扫描显微镜由于激光和荧光的共聚焦成像以及针孔应用，阻止了焦点以外的干扰衍射光和散射光。常用的避免或排除光谱交叉干扰方法有很多种，如同时使用几种荧光探针、降低标记荧光强度以及采用序列扫描等方法。本实验通过使用不同波长激光依次激发样品，同时在相应的荧光检测通道轮流采集并显示每种荧光的共聚焦的序列扫描方式，避免了荧光窜色现象的发生。而为了观察细胞内部微细结构，确保抗体与其对应抗原自由结合，细胞首先必须固定和打孔。免疫荧光方法中固定的目的是迅速终止酶的活性，避免组织细胞结构的解体，将抗原稳定固定在原位，并保持其抗原性。良好的固定剂应能保持细胞及亚细胞结构的真实性，并使抗体大分子进入细胞内与抗原结合［6］。一般分子生物学实验室常用的固定剂分为两大类：有机溶剂和交联剂［7］。有机溶剂如乙醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的网络结构。

目前，尚无一种标准固定剂适用于各种抗原的固定，本实验所采用的3种固定剂在功能上各有优缺点。多聚甲醛通过交联作用更易于保持细胞的结构，但同时也可能降低一些细胞组分的抗原性，细胞胞膜相关组分、细胞器及细胞颗粒内的抗原一般以多聚甲醛固定。相关研究提示，用4%多聚甲醛固定细胞对抗原有很好的保护作用，但Zo-1信号表现得比较模糊，不及用甲醇固定的细胞表达得锐利结实［8］，可能与其对组织穿透力强、保存抗原的免疫活性较好有关。而有文献报道，使用甲醇固定转染绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的细胞会导致GFP的荧光消失，而使用4%多聚甲醛固定时GFP的荧光就没有失去［9］，这也提示我们要针对不同的观察对象选择适合的固定剂。戊二醛可通过固定核蛋白来固定组织和细胞中的DNA和RNA，能保存糖原，但不能避免其他环节造成的脂类抽提，因而对细胞膜的固定效果不理想。而乙醇除有机溶剂固定的优点之外，也有不足之处：可溶解脂类物质；对组织收缩较大，不宜作单纯固定液；渗透力不强；可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白等。通过扫描结果分析，对于细胞骨架的固定可选择单纯的4%多聚甲醛或者添加一些高效去污力的稳定剂（针对多聚甲醛易因为交联作用而造成的杂质污染）。对于细胞间连接等胞膜蛋白，可选择4%多聚甲醛或甲醇进行固定。通过细致的比较、合理的使用固定剂，对于样本制备以及后期扫描观察结果起到至关重要作用，为后续深入研究打下实验基础。

［1］Rubiolo JA，López-Alonso H，Vega FV.Comparative study of toxicological and cell cycle effects of okadaic acid and dinophysistoxin-2 in primary rat hepatocytes［J］.Life Sci，2012，90（11-12）：416-423.

［2］Boucher I，Yu W，Beaudry S.Gα12 activation in podocytes leads to cumulative changes in glomerular collagen expression，proteinuria and glomerulosclerosis［J］.Lab Invest，2012，92（5）：662-675.

［3］Jung SR，Seo JB，Shim D.Actin cytoskeleton controls movement of intracellular organelles in pancreatic duct epithelial cells［J］.Cell Calcium，2012，51（6）：459-469.

［4］Mahmut Y，Gerhard C.EMT，the cytoskeleton，and cancer cell invasion［J］.Cancer Metastasis Rev，2009，28（1-2）：15-33.

［5］David S，Andreas J.Inhibition of actin dynamics during epithelial-tomesenchymal transition［J］.Biochem Bioph Res Co，2012，419（2）：221-225.

［6］DiDonato D，Brasaemle DL.Fixation methods for the study of Lipid dropIets by immunofIuorescence microscopy ［J］.J Histochem Cytochem，2003，51（）：773-780.

［7］ Schmiedeberg L，Skene P，Deaton A.A temporal threshold for formaldehyde crosslinking and fixation［J］.PLoS ONE，2009，4（2）：e4636-e4638.

［8］范瑾瑾，骆宁，董秀清.不同固定剂在激光共聚焦荧光技术中的效果评价［J］.中山大学学报（医学科学版），2009，30（5）：600-604，619.

［9］李荣芳，袁慧，刘定干.甲醇固定导致绿色荧光蛋白的荧光消失［J］.细胞生物学杂志，2007，29（2）：303-304.