鸡病原肠杆菌的鉴定

房 海，陈翠珍，史秋梅，张艳英，马增军，张东林

（河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛 066004）

在肠杆菌属（Enterobacter）细菌中，目前研究较多的主要有阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）及产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes），已被确认可以导致条件性致病，引起呼吸道、泌尿生殖道感染，亦可引起菌血症等。本研究对分离于发病死亡鸡的11株肠杆菌，进行了表观性状及系统发育研究，旨在对鸡源肠杆菌的有效检验与防制等提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 细菌分离 采集河北2个养鸡场2004年6月～2005年6月间商品产蛋发病鸡的病变组织进行细菌分离，根据采集养殖场不同分为1组和2组。根据病变特征，分别取病死鸡的肝组织为材料，划线接种于普通营养琼脂培养基，37℃培养24 h～48 h，分别选取纯一或优势生长的菌落移接于普通营养琼脂培养基斜面进行纯培养。

1.2 细菌主要表观性状检验

1.2.1 形态特征检查取纯培养菌制备涂片标本，经革兰染色后镜检。选择代表菌株做磷钨酸负染色标本，置透射电子显微镜下观察。

1.2.2 主要理化性状测定取纯培养菌分别接种于细菌理化特性鉴定用培养基，按常规进行氧化酶、接触酶、糖（醇及苷）类代谢、有机酸盐利用等的理化特性测定[1-4]。

1.2.3 致病作用检验取从两组分离的代表菌株，分别接种于普通营养肉汤37℃培养18 h调成9×108cfu/mL作为供试菌液，经肌肉0.1 ML/只接种健康雏鸡，每个菌株接种5只，同时设立同剂量、同批无菌营养肉汤接种的对照5只，隔离饲养；每天观察其感染后的发病与死亡情况，以复制出与自然病例症状相同并能重新分离到原感染菌作为相应病原菌的判定指标。

1.2.4 药物敏感性测定取两组分离菌株，采用琼脂扩散法（K-B）进行抗菌类药物的敏感性测定，以出现抑菌圈直径作为相应的敏感与耐药判定指标[5]。

1.3 16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析取不同组分离的代表菌株各1个，用小量细菌基因组DNA抽提试剂盒（TaKaRa产品）提取DNA进行PCR，PCR引物分别为27F：5'-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3'、 1492R： 5'-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3'[6]。扩增产物经纯化后，由上海博亚生物工程技术公司进行基因序列测定。分别对供试菌株的16S rRNA基因序列进行比对，并使用ClustalX 1.83软件进行序列同源性分析。

1.4 菌种归类判定 根据对细菌形态、理化特性的检验结果，参考文献[2]和[3]及有关资料，并结合16S rRNA基因序列与系统发育学的结果，进行供试菌的种属判定。

2 结果

2.1 自然病例与病变组织中的细菌分离 对肠杆菌感染鸡病例进行检验，发病鸡均表现具有肠杆菌感染的败血症、腹泻等特征症状。在病死鸡的病变组织中，均分离到革兰染色阴性、中等大小的杆菌。

2.2 分离细菌与纯培养 对1组的3只鸡、2组的4只鸡肝组织做细菌分离，结果1组均分离得到纯一的同种细菌菌落、2组分离到两种细菌的菌落（A和B）。随机取每只鸡的分离菌落做纯培养，按分离地、分离日期编号，保存供鉴定用。依次为1组的每只鸡1株共3株，编号为HQ040619-1至HQ040619-3；2组的每只鸡2株（A和B各1株）共8株，即A菌4株，编号为HC050612-1、HC050612-3、HC050612-5、HC050612-7，B菌 4株，编号为HC050612-2、HC050612-4、HC050612-6、HC050612-8。

2.3 分离菌株的鉴定结果

2.3.1 形态特征上述11株纯培养菌均为革兰染色阴性、两端钝圆、散在或个别成双排列、无芽孢的杆菌，1组的3株大小为0.6μm～0.8μm×1.0μm～1.3μm，2组的8株其中一种大小为0.5μm～0.8μm×1.2μm～2.0μm、另一种为0.5μm～0.8μm×1.0～1.3μm。透射电镜观察显示菌体杆状、表面似皱褶状、有微泡，1组的HQ040619-1株周生鞭毛和菌毛（图1），2组的HC050612-1株（A菌）周生鞭毛（图2）、HC050612-2（B菌）周生鞭毛和菌毛。

2.3.2 理化特性11株分离菌均为阳性反应结果的项目包括37℃生长、接触酶、O-F试验（F）、葡萄糖产酸、鼠李糖、乳糖、纤维二糖、甘露醇、麦芽糖、棉子糖、果糖、ONPG、硝酸盐还原、V-P试验、动力（半固体）、蔗糖、甘露糖、赤藓醇、丙二酸盐利用、醋酸盐利用、枸橼酸盐利用、海藻糖，在0%、1%及6%NaCl肉汤中生长；均为阴性反应结果的项目包括氧化酶、卵磷脂酶、苯丙氨酸脱氨酶、尿素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂酶、DNA酶，明胶液化、吲哚、甲基红试验、苦杏仁苷、侧金盏花醇、肌醇、卫茅醇、糊精、菊糖；反应结果不一致的项目如表1所示。

图1 显示周生鞭毛和菌毛（×20 000）Fig.1 Peritrichous flagella and pilus（×20 000）

图2 显示周生鞭毛（×20 000）Fig.2 Peritrichous flagella（×20 000）

表1 反应不一致的项目及结果Table 1 Different reactions to the tests among the isolates

2.3.3 人工感染试验的致病作用用HQ040619-1、HC050612-1及HC050612-2株分别感染的健康雏鸡，于感染后96 h全部死亡，剖检可见同自然病例相同的的肝脏肿胀且出现小坏死点、肠道出血等明显病变。对照组雏鸡，观察10 d均正常存活。对各菌株感染死亡鸡，均经剖检后各取2只的肝脏病变组织做抹片经革兰染色镜检细菌及细菌分离，结果均能发现和分离到大量原感染菌。

2.3.4 药物敏感性各菌株对多数头孢类、氨基糖苷类、喹诺酮类、硝基呋喃类等药物敏感；对青霉素类、多肽类的多种药物耐药；对红霉素、多西霉素及头孢类的某些种敏感与耐药在菌株间有差异。

2.4 16S rRNA基因序列与系统发育 将HQ040619-1、HC050612-1及HC050612-4株作为代表菌株进行16S rRNA基因测序（GenBank登录号分别为EU0703021，EU047701，EU047702）与系统进化分析。结果表明，HQ040619-1分离株的16S rRNA基因序列长度为1 421 bp；HC050612-1株为 1 449 bp；HC050612-4株为1 451 bp。这3个菌株的16S rRNA基因序列在NCBI的Blast检索系统进行同源性检索，结果均与肠杆菌属细菌的16S rRNA基因序列自然聚类。在检索出的肠杆菌属序列中，该菌与它们的同源性均在98%～99%。选取了其中部分菌株的16S rRNA基因序列进行系统发育学分析并绘制系统发育树（图3）。

图3 16S rRNA基因序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

2.5 细菌种类判定结果 根据上述所测相应表观性状及代表菌株的系统发育学分析结果，判定被检菌为肠杆菌属细菌。其中分离于1组的3株（HQ040619-1～HQ040619-3）和 2组的 A菌 4株（HC050612-1、HC050612-3、HC050612-5、HC050612-7）为阴沟肠杆菌；2组的B菌4株（HC050612-2、HC050612-4、HC050612-6、HC050612-8）为产气肠杆菌。

3 讨论

产气肠杆菌已作为具有动力的种转入克雷伯菌属，其名为运动克雷伯菌（K.mobilis），在该属细菌中阴沟肠杆菌是一种临床出现频率最高的病原菌，已成为一种重要的医源性病原菌，另外则是产气肠杆菌。

国内外在人类病例分离到本研究涉及杆菌的报道已有多篇[7-13]，发现该菌参与多种人类疾病。在动物的阴沟肠杆菌及产气肠杆菌感染方面目前资料报道较少[14-16]。本研究对2组鸡的肠杆菌感染病例的检验，表明1组为由阴沟肠杆菌的单独感染，另1组为由产气肠杆菌和阴沟肠杆菌的混合感染所致。病鸡缺乏明显症状及剖检病变特征，病死鸡剖检仅见肝脏、脾脏不同程度的肿胀。通过应用分离鉴定的代表菌株对健康鸡进行的人工感染试验，结果不仅能复制出同自然病例的败血症感染发病与死亡，且能重新分离回收到原感染菌，表明所分离鉴定的细菌为被检鸡的相应致病菌，提示在鸡的病原菌检验中应予以注意。

药敏测定结果显示两种菌对所试药物无株间明显差异，该结果可为对肠杆菌耐药谱及耐药规律、选择用药防治等提供一定的参考。考虑到本次所检菌株在区域分布、菌株数量等方面的局限性，要明确认定该菌的耐药规律等还需进行不同区域、不同发病鸡群等大量分离株的检验，同时用药时最好是对分离菌做药敏测定以保证最佳治疗效果。

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