两株H6N2亚型鸡源禽流感病毒的分离鉴定

贾宝琴，焦培荣，韦良孟，单 芬，袁润余，徐成刚，廖 明

（华南农业大学兽医学院 农业部兽用疫苗创制重点实验室 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广州 510642）

禽流感 (avian influenza, AI)是由A型流感病毒引起的禽类一类急性高度接触性传染病[1]，该病在世界各地均有发展，并且对养殖业和人类的健康造成威胁。一些野生水禽，如鸭、鹅、天鹅等是流感病毒的天然宿主，在流感病毒的自然生态学中发挥着重要作用。H6亚型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)最早分离于鸭，后来发现也能够传播给鸡[2,3]。虽然低致病性AIV（low pathogenic Avian influenza virus , LPAIV）没有高致病性AIV（highyly pathogenic Avian influenza virus, HPAIV）危害性大，对其研究也相对较少，但是近几年H6亚型AIV在中国和其他一些国家及地区的野鸟和家禽中广泛存在，其流行和传播趋势呈上升趋势[4]。1963年，加拿大最早从火鸡中分离到H6N2亚型的禽流感病毒（A/turkey/Canada/63（H6N2））（见GenBank数据库）。1977年香港从鸭中分离到H6N2亚型禽流感病毒（A/duck/Hong Kong/134/77（H6N2））。2000年2月，低致病性H6N2亚型禽流感在美国加利福尼亚暴发，从散养的家禽和商品鸡均可分离出禽流感病毒[5,6]。研究表明，在1997年暴发的香港禽流感事件中，导致人感染死亡的H5亚型AIV的内部基因来源于香港地区的H6亚型AIV[7]。中国2000年已有关于H6亚型AIV分离鉴定的报道[4]，在人群中检测到H6亚型AIV的特异性抗体[8]，表明该亚型病毒能够感染人。

本次研究主要是对在中国广东省进行分子流行病学时采集到的拭子中病毒进行分离鉴定，从而为更好地了解禽流感病毒的流行情况和宿主范围等方面的研究提供数据，为我国更好地预防和控制禽流感的发生、流行提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本和鸡胚 2009年采自广东省某活禽交易市场的100份鸡源泄殖腔拭子样本，由华南农业大学兽医学院禽病研究室提供；10日龄SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.1.2 试 剂 AMV Reverse Transcriptase、ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、载体质粒pMD18-T、工程菌JM109等购自大连宝生物工程公司；Trizol Reagent、RNase Inhibitor购 自 Invitrogen公 司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为天根生物科技有限公司产品；抗流感病毒标准阳性血清由华南农业大学兽医学院禽病研究室提供；抗鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）及减蛋综合征病毒的标准阳性血清由华南农业大学兽医学院禽病室提供。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分离及HA亚型鉴定 将采集的鸡拭子按照世界动物卫生组织推荐的标准方法处理后[9]，取上清液，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1 mL，37 ℃孵化48 h后，收集鸡胚尿囊液，测定血凝价。将具有血凝价活性的鸡胚尿囊液分别与抗NDV、减蛋综合征病毒、H6亚型禽流感病毒的标准阳性血清进行血凝抑制（HI）试验，具体操作程序按照世界动物卫生组织推荐的标准方法进行[9]，将鉴定过的病毒纯化并分装，保存于-70℃备用。

1.2.2 病毒特异性片段的RT-PCR扩增以及序列测定1.2.2.1 引物设计 参考GenBank数据库中禽流感病毒序列设计针对M基因、HA基因、NA基因特异性鉴定引物，HA和NA基因全长扩增引物，以及流感病毒反转录通用引物Uni-12。引物由上海英骏公司合成，引物序列略。

1.2.2.2 病毒RNA的提取与RT-PCR 取1.2.1获得的250 μL病毒尿囊液，加入750 μL Trizol Reagent RNA提取液，按照说明书提取病毒总RNA。用流感病毒反转录通用引物Uni-12，按照AMV反转录酶使用说明书进行反转录，合成的cDNA直接用1.2.2.1设计的特异性引物进行PCR扩增，PCR产物纯化回收并测序。另外，RT-PCR鉴定时设有阴性对照组，以去离子水为模板用M、HA、NA鉴定引物进行扩增。

1.2.2.3 基因克隆和测序 将1.2.2.2获得的全长HA、NA基因特异性PCR扩增产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化后与pMD18-T载体连接，连接产物转化至JM109感受态细胞，经鉴定的阳性重组质粒送深圳华大基因公司进行序列测定，测得序列与GenBank中流感病毒的HA和NA基因序列进行BLAST分析。

2 结果与讨论

2.1 病毒的分离及鉴定 拭子样品接种鸡胚后观察至48 h没有出现死胚，收集鸡胚尿囊液，发现其中编号为65和C7的两份拭子的尿囊液能够凝集鸡红细胞，血凝价达到9log2。抗ND病毒和减蛋综合征76病毒的标准阳性血清不能够对该病毒血凝产生抑制作用，而抗H6亚型禽流感病毒标准阳性血清能够产生抑制作用，血凝抑制效价达到8log2，从而表明这两份尿囊液含有H6亚型禽流感病毒。

2.2 特异性鉴定引物PCR扩增结果 分别用针对禽流感病毒M基因、H6亚型禽流感病毒HA基因、N2亚型禽流感病毒的NA基因的特异性鉴定引物对65号分离物和C7分离物的cDNA产物进行PCR扩增，依次获得大小为299、1744、 1466 bp的特异性扩增片段（见图1）。

图1 分离株的M、 HA、 NA基因RT-PCR扩增产物Fig.1 RT-PCR products of M , HA and NA gene of the isolates

2.3HA、NA基因的序列测定及分析 获得的HA和NA基因片段大小分别在1744 bp和1466 bp，与预期的大小相符，图略。将测得的HA和NA基因序列经 DNASTAR Version 7.1 （Madison，WI，USA）软件包中的Seqman软件校对正确无误后，登录GenBank进行Blast分析，各基因与GenBank中核苷酸序列相似性最高的毒株列于表1。

表1 分离毒株与GenBank中核苷酸序列相似性最高的毒株Table 1 The isolates with the highest homdogy with 65 and c7 in GenBank

从表1中可以看出分离株65的HA基因核苷酸序列与汕头鸭源分离株 A/duck/Shantou/339/2000（H6N2）的核苷酸序列相似性最高，达到95%，而NA基因与海南鸭源分离株A/duck/Hainan/4/2004（H6N2）的核苷酸序列相似性达95%。分离株C7的HA基因核苷酸序列与汕头鸭源分离株A/duck/Shantou/2472/2005（H6N2）的核苷酸序列相似性最高，达到97%，而NA基因与汕头鸭源分离株A/duck/Shantou/2472/2005（H6N2）的核苷酸序列相似性最高，达到95%。综上所述，该两分离株鉴定为H6N2亚型鸡源禽流感病毒，根据禽流感病毒通用命名法则分别命名为A/Chicken/Guangdong/65/2009（H6N2）、A/Chicken/Guangdong/C7/2009（H6N2）。

2.4 H5亚型HPAIV的高死亡率，以及H9亚型LPAIV在家禽中的广泛存在，使得这两种亚型的AIV一直受到人们的普遍关注。H6亚型AIV由于为低致病性病毒，虽然近年来不断有H6N1和H6N2亚型AIV疫情的报道[10-13]，但由于其发病率较低，一直没有引起人们重视。然而，H6亚型禽流感病毒不仅可以向H5亚型高致病性禽流感病毒（HPAIV）和H9N2亚型禽流感病毒提供内部基因片段，而且还可以感染鼠和雪貂[14]，甚至人[8]。

近年来，随着AIV在全世界范围的流行，病毒的变异也日渐加强，HPAIV 对人类的危害性也日益增大。这也提示我们，在宿主混合感染LPAIV的条件下，有可能引起AIV发生基因突变和重组，改变HPAIV的生物学特性，增加HPAIV防控的难度。有研究曾指出,北美与欧洲部分地区的鸭群中H3 、H4 及H6亚型流感病毒的分离率最高，因此H6亚型LPAIVs的公共卫生意义应予以重视。开展H6亚型病毒的分子流行病学和生物学特性研究，对于进一步评价H6亚型AIV对当前我国养禽业的危害、在高致病性AI防控体系中对H5亚型AIV的变异方面所起的作用，以及加强我国AIV的综合防控有着重要的意义。

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