狂犬病病毒磷蛋白在杆状病毒系统的表达及鉴定

许运斌，徐洁萍，张金阳，昝 洁，阮系真, 周继勇,2

（1.浙江大学 农业部动物病毒学重点实验室，杭州 310029；2.浙江大学 传染病诊治国家重点实验室，杭州 310003）

狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的一种能够导致几乎所有温血动物致死性脑炎的人兽共患传染病，死亡率几乎达到100%。在亚非拉等发展中国家，狂犬病一直是困扰当地人类与动物健康的重要公共卫生问题，据WHO统计全世界每年5.5万人死于狂犬病[1]。中国是狂犬病的高发地区，人的狂犬病病死数位居世界第二，仅次于印度。据国家疾病控制中心发布的疫情报告，自2002年以来每年因该病死亡的人数均超过2000人，并且逐年上升，在2007年达到高峰期，年死亡人数达3302人。狂犬病是当前严重危害中国公共卫生的重大疫病[2]。

狂犬病病毒（Rabies virus，RV）是弹状病毒科（Rhabdoviridae）、狂犬病病毒属（Lyssavirusgenus）的成员，为不分节段的单股负链RNA病毒，基因组长度为11 928～11 932 nt，由5种结构基因组成，从基因组的3'端到5'端分别编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和RNA聚合酶（L）5种结构蛋白。其中P蛋白是一种高度亲水性蛋白，与N蛋白和L蛋白一起负责病毒RNA转录和复制[3]。

作为RV的重要结构蛋白，21世纪以来研究人员对P蛋白的功能研究已取得相当的成绩。2000年Raux等[4]和Jacob等[5]发现了RV P蛋白与动力蛋白轻链亚基LC8的相互作用，认为这种相互作用可能在RV轴突逆向轴浆运输中发挥着重要的作用。但Tan等[6]研究表明缺失LC8结合基序的RV重组病毒依然可侵入中枢神经系统，只不过RV在神经细胞中的复制和转录稍微有所减弱。2002年Blondel等[7]进一步发现P蛋白与干扰素诱导蛋白PML之间的相互作用。2005年Vidy等[8]和2006年Brozozka等[9]研究表明P蛋白可与激活的STAT1和STAT2结合，阻断其入核转运并且抑制干扰素信号转导通路，最终抑制感染细胞的抗病毒反应。

尽管如此，关于P蛋白的研究还是相对比较局限。本研究通过Bac-To-Bac杆状病毒系统首次成功表达了RV的P蛋白，不仅为蛋白多抗或单抗的制备筛选、蛋白结构的解析以及蛋白功能的全面研究奠定基础，而且为狂犬病酶联免疫吸附测定（enzyme linked immuno-soebent assay, ELISA） 抗体诊断试剂盒的开发提供一个新的思路。

1 材料与方法

1.1 病毒株、菌种、细胞和载体 RV ERA毒株、E.coliDH10Bac、TOP10感受态细胞、昆虫细胞系Sf9由浙江大学农业部动物病毒学重点实验室保存；杆状病毒表达载体pFastBacHTA购自Invitrogen公司。

1.2 工具酶及试剂Taq酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、蛋白质和DNA分子量标准物购自TaKaRa公司；小量DNA胶回收试剂盒购自AxyGen公司；反转录试剂盒为MBI公司；FITC标记羊抗鼠IgG购自KPL公司；鼠抗磷蛋白单克隆抗体7B3由本实验室制备；Ni-NTA琼脂糖凝胶镍柱购自QIAGEN公司。

1.3 引物 根据GenBank登录的RV ERA株磷蛋白基因序列（EF206707），设计合成扩增RV磷蛋白基因的特异性引物，RV-P-F-Prim：5'-GCCGAAT TCATGAGCAAGATCTTTGTC-3'（上游）；RVP-R-Prim：5'- GACGTCGACTTAGCAAGATGTA TAGCG -3'（下游）。上下游引物的5'端分别引入EcoR I和SalI酶切位点。M13通用引物序列参照英骏公司Bac-To-Bac杆状病毒表达系统使用手册设计。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.4 重组杆状病毒转移载体的构建 从感染ERA株RV的细胞中抽提病毒的总RNA，反转录合成cDNA，用设计的特异性引物对磷蛋白基因进行PCR扩增，PCR反应程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性 15 s、60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸70 s，共30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物和pFastBacHTA转移载体经EcoR I和SalI双酶切后分别回收，将连接产物转化TOP10感受态细胞，经双酶切及特异性引物PCR鉴定为阳性的质粒（pFastBacHTA-P）送上海英骏公司测序鉴定。将序列正确的重组转移载体pFastBacHTA-P转化到E.coliDH10Bac感受态细胞中，经过蓝白斑筛选和PCR鉴定重组转座子rBacmid-P。

1.5 重组杆状病毒制备 将重组转座子rBacmid-P在Cellfectin II Reagent介导下以5:6的比例转染处于对数生长期的Sf9细胞，27℃无CO2培养72 h，待细胞发生明显病变后收集细胞上清为P0代病毒毒液，经3次传代后得到含有磷蛋白基因的重组杆状病毒为毒种液。

1.6 重组蛋白的纯化 用PBS重悬并收集病变细胞，94×g离心10 min，沉淀溶解在含有10 mmol/L imidazole的lysis buffer中，反复冻融3次后，4℃下通过超声裂解细胞（频率为0.4～0.6 kW，工作时间2 s，间歇2 s，全程时间90 s，重复2次），13 523×g离心30 min，取上清，按照QIAGEN公司His融合蛋白纯化试剂盒说明书步骤天然条件下纯化可溶蛋白。

1.7 表达蛋白的鉴定

1.7.1 间接免疫荧光（indirect immunofluoreseent assay，IFA）检测表达的RV磷蛋白 用重组病毒rBacmid-P感染Sf9细胞，72 h后弃去培养基，PBS洗涤3次，以固定液（4%甲醛）于常温下固定细胞约20 min，晾干，同时以未感染病毒毒液的正常Sf9细胞作阴性对照。以鼠抗狂犬病病毒磷蛋白单克隆抗体7B3（1:800）作为一抗于37℃孵育1.5 h，PBS洗涤3～5次，再用FITC标记的羊抗鼠（1:400）于37℃孵育1 h，PBS洗涤3～5次，荧光显微镜下观察荧光反应。

1.7.2 重组蛋白的SDS-PAGE与Western blot分析将重组病毒rBacmid-P感染Sf9细胞，当细胞出现明显病变时，按照1.6的方法进行重组蛋白的纯化，然后对其进行SDS-PAGE和Western blot分析，同时以野生型病毒感染的细胞作为阴性对照。

2 结果

图1 pFastBacHTA-P的双酶切鉴定（A）和rBacmid-P的PCR鉴定（B）Fig.1 Identif i cation of pFastBacHTA-P and rBacmid-P by restriction enzymedigestions（A） and PCR（B）

2.1 重组杆状病毒转移载体的构建 采用RT-PCR技术，用特异性引物RV-P-F/R-Prim从感染细胞总RNA中扩增出约900 bp大小的磷蛋白基因cDNA片段。将PCR产物和转移载体pFastBacHTA经EcoR I和SalI双酶切后连接，转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，经双酶切鉴定pFastBacHTA-P重组质粒，插入的磷蛋白基因与预期大小符合（图1A）。以rBacmid-P为模板，用M13通用引物进行PCR鉴定，扩展出约3300 bp的片段，表明磷蛋白基因已经转座成功（图1B），而未发生转座的Bacmid片段大小为300 bp。

2.2 重组病毒的包装 重组杆状病毒转座载体rBacmid-P的DNA在Cellfectin介导下以5:6的比例转染入Sf9细胞，在转染后48 h可观察到转染的细胞出现生长停止，直径变大，细胞形态大小不一等病变，随着时间的延长，到转染后96 h，细胞出现较大范围的脱落。而正常细胞则细胞直径较小，且细胞大小较为均匀（图2），表明重组杆状病毒包装成功。

2.3 SDS-PAGE与Western blot分析磷蛋白的表达Sf9细胞接种重组病毒后，首先进行重组蛋白的纯化，然后经SDS-PAGE电泳分析，在约42 kDa处有明显条带，病毒感染72 h后细胞病变明显，在接毒后72～96 h蛋白表达量最高。用抗His标签的单克隆抗体作为一抗进行Western blot分析，结果出现与预期分子量大小相符的特异性条带，同时利用正常未感染重组病毒额细胞作为阴性对照，其相应位置没有条带出现，表明RV磷蛋白在昆虫细胞内获得表达（图3）。

图2 重组杆状病毒基因组转染前后Sf9细胞的形态图（200×）Fig.2 Morphological changes of Sf9 cells infected with baculovirus（200×）

图3 Western blot（B）和SDS-PAGE（A）分析狂犬病病毒磷蛋白在昆虫细胞中的表达Fig.3 Western blot analysis（B）and SDS-PAGE（A）of the expression of phosphoprotein in Sf9 cells

2.4 Sf9细胞表达蛋白的IFA检测 利用鼠抗磷蛋白的单克隆抗体7B3通过IFA对重组病毒感染的昆虫细胞进行检测。结果表明（见图4），重组杆状病毒感染的Sf9细胞可以与鼠抗狂犬病毒磷蛋白单克隆抗体发生反应，产生特异性的亮绿色荧光，而未感染重组杆状病毒的细胞则呈阴性反应，未出现荧光，表明RV磷蛋白在昆虫细胞内获得表达。

图4 IFA分析RV磷蛋白的表达（200×）Fig.4 Detection of rabies virus phosphoprotein expression by IFA（200×）

3 讨论

本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在大肠杆菌中构建含有RV P基因的重组杆状病毒基因组，拯救出具有复制能力的重组杆状病毒，重组杆状病毒感染Sf9细胞后，用Western blot检测到相对分子量约为42 kDa狂犬病毒P蛋白，首次实现了狂犬病毒P蛋白在昆虫细胞中的表达。由于使用的pFastBacHTB载体提供的起始密码子能使基因高效表达，且由多聚组氨酸标记的表达产物可被金属亲和树脂快速纯化，我们利用亲和层析的方法进一步得到了高纯度的重组P蛋白。由此，证明本试验已建立了狂犬病毒P蛋白的真核表达系统。

就不同的基因工程表达系统而言，原核表达系统具有成本低廉、操作简单、生产周期短、表达量高、表达蛋白易于纯化等优点，得到了广大科研工作者的青睐。本实验室2007年在大肠杆菌中实现了RV核蛋白的高效表达[10]，但该系统表达的蛋白缺少翻译后修饰加工，这使得表达的蛋白与天然蛋白存在抗原性差异。酵母蛋白表达系统具有表达量高、糖基化机制接近高等真核生物、分泌蛋白易纯化、易实现高密发酵等优点，也不断地得到应用。但Klepfer等[11]研究表明，在酵母中表达的RV糖蛋白在糖基化类型和位点上与天然蛋白存在差异，由此影响其免疫原性，而且表达蛋白产物易降解，表达量不可控。2007年Zhang等[12]在腺病毒中表达了G蛋白，但这种病毒载体存在潜在的安全性问题。真核表达Bac-To-Bac杆状病毒系统是一种利用杆状病毒作为载体，在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统，具有同多数高等真核生物相似的转译蛋白的能力以及翻译后修饰、加工的过程，表达的蛋白一般具有可溶性，且抗原性和生物学功能非常接近天然的病毒蛋白，具有良好的生物学活性、安全性，表达水平高[13,14]。目前为止，已有成千上万的蛋白应用该系统得到了有效的表达，国内外采用该系统表达RV G蛋白、N蛋白已有相关的报道[15-17]，本试验利用该系统成功表达了狂犬病毒P蛋白，该重组蛋白能与抗狂犬病毒磷蛋白单克隆抗体发生特异性反应，表明P蛋白在昆虫细胞内发生了正确的折叠，具有良好的反应性。这种与单克隆抗体具有良好免疫反应性P蛋白体系的建立为进一步的狂犬病病毒P蛋白结构的解析，以及狂犬病ELISA抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。

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