猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a/ORF5 重叠区的分离

刘闰夏, 蔺 涛,2, 田德斌,韦祖樟, 孙利厂,2, 陆嘉琦, 袁世山, 童光志

(1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.南京农业大学动物医学院，南京 210095)

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病 毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的猪的一种高度接触性传染病，主要引起母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸系统疾病，给养猪业造成了严重危害和巨大的经济损失[1,2]。PRRSV与马动脉炎病毒、小鼠乳酸脱氢酶病毒和猴出血热病毒同属于动脉炎病毒科，动脉炎病毒属[3-5]。根据血清型和遗传特性的差异，PRRSV分为两个基因型，即欧洲（I）型和美洲（II）型，两型同源率约为60%[6-9]。

目前已知PRRSV基因组有10个首尾重叠的开放阅读框（open reading frame，ORF），其中ORF1a和ORF1b编码病毒的非结构蛋白，ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4和ORF5编码囊膜蛋白，ORF6和ORF7分别编码膜基质蛋白M和核衣壳蛋白N，ORF5a是最新发现的普遍存在于动脉炎病毒中的ORF，它编码5a蛋白[10,11]。ORF5a大部分序列与ORF5重叠甚至完全包埋在ORF5中，它们可能由同一个亚基因组sg mRNA5转录，但使用不同的读码框[12]。目前人们对5a蛋白了解甚少，深入研究5a蛋白的结构与功能对于全面认识PRRSV的结构蛋白及其相互作用具有重要意义。但是ORF5a绝大部分序列与ORF5重叠，我们只有在保证不改变ORF5氨基酸编码序列的前提下，通过突变ORF5a的个别核苷酸来改变5a蛋白的氨基酸序列进而研究5a蛋白的功能，这使得研究内容非常有限。

本研究利用PRRSV反向遗传系统[13]，将I型PRRSV的ORF2～ORF5a替换进II型PRRSV的相应区域，目的是探讨I型5a蛋白及其编码基因能否在II型PRRSV中发挥作用，同时期望将I型PRRSV的ORF5a从ORF5中独立出来，从而为进一下研究5a蛋白的结构与功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与质粒 仓鼠肾传代细胞BHK-21购自美国ATCC；非洲绿猿猴肾细胞（MARC-145）细胞由本实验室保存；基因I型PRRSV全长感染性克隆pSHE（GenBank登录号：GQ461593），基因II型PRRSV全长感染性克隆pAPRRS(GenBank登录号为GQ330474)均由中国农业科学院上海兽医研究所猪病实验室构建和保存[14]；pAPRRSasc是在pAPRRS的ORF1b与ORF2之间插入AscI位点的全长感染性克隆，由田德斌博士构建[15]。

1.1.2 主要试剂 SOE-PCR用聚合酶pfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase购自Stratagene公司；T4 DNA连接酶和限制性内切酶购自NEB公司；TOP10感受态细胞购自TIANGEN公司；病毒上清RNA抽提试剂盒QIAgen Viral RNA Mini Kit购于QIAGEN公司；化学转染试剂”LTX and PLUS”和细胞总RNA提取试剂TRIZOL®reagent购自Invitrogen公司；AMV反转录酶购自TaKaRa公司；免疫荧光试验所用北美型PRRSV 抗N蛋白单克隆抗体由南达科他州立大学（South Dakota State University）方英博士惠赠；针对5a蛋白的多克隆抗体由北京康为世纪物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参照vARRS和vSHE病毒基因组序列，利用OLIGO软件设计（表1）。

1.2.2 全长嵌合克隆的构建 pAPRRS-SHE2345a是通过SOE-PCR将pSHE的ORF2～ORF5a替换进pAPRRS的相应区域。以pSHE为模板，利用上游引物FS234asc（含AscI位点）和下游引物RS5a-A5扩增pSHE的ORF2～ORF5a序列S2345a，同时以pAPRRS为模板，利用上游引物FS5a-A5和下游引物RA14780扩增pAPRRS的ORF6序列A6，然后以回收纯化的DNA片段S2345a和A6为模板，上游引物FS234asc和下游引物RA14780扩增杂和片段S2345a-A6。用AscI和XbaI双酶切杂和片段S2345a-A6和全长克隆pAPRRSasc，回收目的片段，由T4 DNA连接酶连接获得全长嵌合质粒pAPRRS-SHE2345a。另外，在pAPRRS-SHE2345a的基础上引入pAPRRS TRS5，同时分别保留和突变pAPRRS ORF5a的起始密码子，构建两个嵌合质粒pAPRRSSHE2345aT1 和 pAPRRS-SHE2345aT2(图 1)， 构建方法同上。构建的全长质粒都通过测序和SmaI酶切鉴定。

1.2.3 细胞转染 用于细胞转染的质粒用QIAGEN质粒提取试剂盒进行提取，并于转染前测定质粒浓度。待BHK-21细胞长满单层约80%左右，用LTX &PLUS reagent转染3 μg质粒，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，收上清感染MARC-145细胞。每天观察细胞，待细胞病变（cytopathic effect，CPE）达80%时收取细胞上清标记为第1代（P1），连续传代至P5代；若未产生CPE，则在传到MARC-145细胞d6收取上清，继续盲传3代以确定其感染性。

1.2.4 病毒RNA提取及RT-PCR检测 对于产生CPE的感染性克隆，用QIAampViral RNA试剂盒提取P5代病毒RNA。 以提取的RNA为模板，RA14780为引物，用AMV反转录获得cDNA。然后以cDNA为模板，FA12066/RA14780为扩增引物，用pfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶进行PCR扩增。扩增出的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定及纯化后，送上海杰李生物技术有限公司测序。

表1 构建嵌合cDNA克隆所需引物Table 1 Primers used for construction of full-length cDNA clones

图1 嵌合克隆构建示意图Fig.1 Construction of chimeric cDNA clones

1.2.5 嵌合病毒亚基因组的检测 转染BHK-21细胞24 h后，用TRIzol试剂提取细胞总RNA，AMV反转录获得cDNA。以cDNA为模板，SF12/SR14365为上下游引物扩增sg mRNA5。PCR产物纯化后连接目的片段至pGEM-T载体，22 ℃快速连接10 min，挑取10个白斑送上海杰李生物技术有限公司测序。

1.2.6 间接免疫荧光试验（indirect fluorescence assay,IFA） 转染BHK-21细胞24 h时，用冰甲醇固定细胞10 min，然后以1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 室 温 封 闭 30 min； 加 入PRRSV N蛋白的特异性单抗，37 ℃孵育2 h，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤细胞5次；加入lexa Fluor®568羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗5次后于荧光显微镜下观察结果并拍照。

1.2.7 嵌合病毒的多步生长曲线 以0.01 MOI（multiplicity of infection）P3代病毒感染MARC-145细胞，分别在感染后不同时间点（12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h） 收 集 病毒上清200 μL， 同时补充200 μL含2%FBS的MEM。测定各时间段病毒的滴度，并用GraphPad软件绘制病毒的多步生长曲线。

1.2.8 嵌合病毒的空斑形态学分析 将P3代病毒500 μL/孔感染6孔板中的MARC-145细胞，37 ℃孵育1 h。加入等比例的2%低熔点琼脂糖与2×MEM（含2%FBS），5 mL/孔铺到细胞板中，室温凝固后于培养箱中倒置培养4～5 d。待出现空斑后，加入4%的甲醛溶液固定细胞1 h，去除凝胶并用5%结晶紫染色即可观察空斑形态。

2 结果

2.1 嵌合感染性克隆的构建及鉴定 在欧洲型pSHE和北美型pAPRRS两个全长感染性克隆的基础上，通过SOE-PCR的手段将欧洲型的ORF2～ORF5a替换入北美型PRRSV骨架中，成功构建了3个嵌合克隆。pAPRRS-SHE2345a属于ORF2～ORF5a的完全替换，目的是使pSHE的ORF5a及pAPRRS的ORF5利用pSHE的TRS5完成转录。pAPRRS-SHE2345aT1是在pAPRRSSHE2345a的ORF5起始密码子之前加入pAPRRSORF5起始密码子之前的58个碱基（包括pAPRRS TRS5及ORF5a的起始密码子），目的是使嵌合克隆利用pAPRRS TRS5完成ORF5的转录，但同时引入了pAPRRS的ORF5a，即有两个完整的ORF5a（分别属于pSHE和pAPRRS）同时存在于pAPRRS-SHE2345aT1。为使嵌合克隆只表达pSHE的5a蛋白，我们突变pAPRRS的ORF5a的起始密码子构建了第三个嵌合克隆pAPRRSSHE2345aT。所有全长克隆均经SmaI酶切鉴定，与亲本质粒pAPRRS切出的条带完全相同（图2）。

图2 全长克隆Sma I酶切图谱Fig.2 Identify the full-length cDNA clones by Sma I digestion

2.2 嵌合对病毒结构蛋白表达的影响 所有嵌合克隆转染BHK-21细胞24 h后，进行免疫荧光检测细胞内5a、GP5和N蛋白的翻译情况。如图3所示，嵌合克隆都能检测到5a蛋白和N蛋白的表达。vAPRRS-SHE2345aT1 和vAPRRS-SHE2345aT2能检测到GP5的表达，但vAPRRS-SHE2345a没有检测到GP5表达，可能是由于GP5表达的翻译起始信号存在于ORF5起始密码子之前的序列中，而在构建时并没有将这些序列嵌合到pAPRRSSHE2345a中，从而影响了GP5蛋白的翻译。

图3 结构蛋白的间接免疫荧光分析Fig.3 Detection of the expression of structure proteins by indirect fl uorescence assay

2.3 子代病毒的拯救及嵌合序列的稳定性 为了验证嵌合克隆对病毒感染性的影响，用BHK-21的转染上清感染Marc-145细胞，vAPRRSSHE2345aT1和vAPRRS-SHE2345aT2都能拯救感染性的到病毒粒子，而pAPRRS-SHE2345a由于不能表达GP5而没有得到拯救病毒。将vAPRRSSHE2345aT1和vAPRRS-SHE2345aT2在Marc-145细胞上传至P5代，提取病毒RNA，用RTPCR方法对嵌合病毒的结构蛋白区域（ORF2a-ORF6）进行扩增测序，测序结果发现该段嵌合序列在核苷酸水平上没有发生任何突变，表明I型PRRSV的结构蛋白序列能够稳定存在于II型PRRSV基因组中，而且vAPRRS-SHE2345aT2能够利用独立存在的pSHE ORF5a序列成功表达5a蛋白。

2.4 嵌合克隆亚基因组的检测 转染BHK-21细胞24 h后，收集细胞总RNA，能够检测到嵌合克隆的sg mRNA5及sg mRNA7（图4），说明嵌合克隆不影响病毒亚基因组的转录。由于嵌合克隆的sg mRNA5都是由pAPRRS和pSHE的部分序列嵌合而成，所以形成的条带都大于vAPRRS的sg mRNA5。

图4 RT-PCR方法检测ORF5及ORF7的转录Fig.4 Detection of sg mRNA5 and sg mRNA7 by RT-PCR

2.5 拯救病毒的多步生长曲线 通过绘制病毒的多步生长曲线(图5)，结果显示嵌合病毒vAPRRSSHE2345aT1达到高峰的时间为感染后60 h，而骨架亲本病毒vAPRRS、供体亲本病毒vSHE及嵌合病毒vAPRRS-SHE2345aT2达到高峰的时间均为感染后72 h，比较生长曲线发现嵌合病毒与亲本病毒具有相似的增殖能力。

图5 病毒的多步生长曲线Fig.5 Virual multi-step growth curve

2.6 嵌合病毒的空斑形态学分析 将嵌合病毒vAPRRS-SHE2345aT1、 vAPRRS-SHE2345aT2和亲本病毒vAPRRS、vSHE的P3代病毒进行空斑形态分析（图6），结果表明嵌合病毒与亲本病毒空斑的大小及形态并无明显区别，说明嵌合病毒在MARC-145中的增殖及扩散能力与亲本病毒相似。

3 讨论

5a蛋白是最新发现的在动脉炎病毒中普遍存在的第8个结构蛋白，通过对ORF5a的基因序列分析发现，ORF5a绝大部分甚至全部与ORF5重叠，而且采用不同的读码框，这对我们研究5a蛋白的结构与功能带来极大的困难。孙利厂等就是通过突变单个碱基证明了5a蛋白的存在是PRRSV复制所必需的，同时证明了5a蛋白的适当延长不影响病毒的感染性（未发表）。如果我们将ORF5a从ORF5序列中独立出来，就能在不破坏GP5编码序列的前提下单独研究5a蛋白的功能，从而为进一步研究动脉炎病毒的蛋白结构与功能的关系提供一定的理论基础。田德斌等[15]将欧洲型PRRSV的ORF2-5a序列成功替换入北美型pAPRRS的相应区域，得到拯救病毒并且嵌合序列能够稳定存在于嵌合病毒中，这给本研究感染性克隆的构建提供了材料和方法。

本研究利用反向遗传技术，将欧洲型感染性克隆pSHE的ORF2-5a替换入北美型感染性克隆pAPRRS的相应区域，构建了全长嵌合克隆pAPRRS-SHE2345a， 使pSHE的ORF5a独 立 存在，但是没有得到拯救病毒。通过对其亚基因组及免疫荧光检测分析，骨架vAPRRSORF5利用pSHE的TRS5完成转录得到完成的嵌合sg mRNA5，但可能由于vAPRRSORF5起始密码子前与GP5表达相关的翻译起始序列没有被嵌合入pAPRRSSHE2345a，导致pAPRRS-SHE2345a的GP5蛋白没有翻译，因此未拯救到有感染性的病毒粒子。因此我们又构建了pAPRRS-SHE2345aT1，引入了pAPRRSORF5起始密码子前的58个核苷酸（包括pAPRRS TRS5及其侧翼序列、ORF5a的起始密码子）以确保vAPRRS的GP5表达。由于pAPRRSSHE2345aT1中有两个完整的ORF5a（分别属于pSHE和pAPRRS）同时存在，所以该嵌合病毒可能同时表达vSHE和vAPRRS的5a蛋白。通过多步生长曲线可以看出，vAPRRS-SHE2345aT1达到最高滴度的时间比两个亲本病毒早12 h，而且最高滴度高于亲本病毒的最高滴度，暗示5a蛋白影响病毒的复制效率。构建了pAPRRS-SHE2345aT2突变pAPRRS的ORF5a的起始密码子，以确保只有拉开的pSHE的ORF5a表达的5a蛋白在嵌合病毒中发挥作用。

图6 空斑形态学比较Fig.6 Viral plaque morphology assay

总之vAPRRS-SHE2345a的拯救失败及vAPRRS-SHE2345aT1、 vAPRRS-SHE2345aT2 的拯救成功说明了病毒ORF前存在与亚基因组转录、蛋白翻译相关的作用元件，但具体是哪部分序列还需要下一步实验证明。vAPRRS-SHE2345aT2成功将ORF5a拉开，证明了PRRSVORF5a是可以独立于ORF5存在的，为进一步研究5a蛋白的结构与功能奠定了基础。

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