A组轮状病毒的基因组及其蛋白研究进展

杨 盟，周建国，马海利

（1.山西农业大学动物科技学院，太谷 030801；2.河北省迁安市畜牧水产技术中心，迁安 064400）

轮状病毒（Rotavirus，RV）是呼肠孤病毒科（Reoviridae）、轮状病毒属（Rotavirus）的典型代表。自1963年被Adams等[1]证实可引起小鼠腹泻以来，现已成为引起哺乳类和禽类动物病毒性腹泻的主要病原微生物之一。轮状病毒感染引起的疾病广泛分布于世界各地，病人、患病动物和隐形感染的动物为主要传染源，粪—口途径是RV感染的最主要传播途径。

完整的RV颗粒为球形，直径大约60～80 nm，也有直径为50 nm左右的缺损病毒。RV无包膜，具有多层核衣壳形态学特征，同时还具有成节段的双链RNA基因组和在宿主细胞浆内复制等理化特性。RV根据其基因组结构和抗原性分为A～G等7个组。A组、B组、C组可引起人类和动物感染，而D组、E组、F组、G组主要引起动物感染[2]。其中A组RV在人类和动物中感染最为普遍。

1 基因组结构

轮状病毒的基因组为dsRNA，全长介于0.6～3.3 kb之间。基因组由11个片段组成，编码6种结构蛋白和6种非结构蛋白。根据基因在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的位置，由大到小依次命名为基因1至基因11[3]。A组RV有特异性电泳图形，包括4个高分子量基因，5个中分子量基因和2个小分子量基因，此为A组RV特异性图形。但这不能作为RV分组的绝对标准[4]。

组成RV的每个基因片段具有共同特征，即5′末端和3′末端序列高度保守。在5′末端有一个鸟嘌呤核苷酸，紧随其后为5′末端保守序列，再后为开放读码框，编码一种蛋白质产物，在终止密码之后为3′末端保守序列[5]。另外，RV基因中富含A和T，其比值高达65%左右，这也是与大多数病毒的相异之处[6]。

RV在同一组内可以进行基因重组，这种现象曾经在许多国家及地区发生。在斯洛文尼亚，Steyer等[7]收集猪、牛和人的粪便，采用RT-PCR对A组轮状病毒进行测序分析发现，在人轮状病毒G3P[6]基 因 型 SI-MB6株 中 编 码 VP6、VP7、 VP8*和NSP4蛋白的基因核苷酸序列和猪的核苷酸序列具有同一性。在印度东部，Mukherjee等[8]对3岁儿童感染的A组轮状病毒G9P[6]株进行全基因序列分析发现，VP1～VP3、NSP1～NSP3和NSP5与猪轮状病毒P[6]株高度相似。Chitambar等[9]通过对罕见的G1P轮状病毒株研究发现，人类VP7/VP6基因和猪VP4/NSP4基因之间发生重组。在厄瓜多尔[10]、韩国[11]、中国[12]、中国台湾[13]等地也有A组轮状病毒组内重组的报道。此外，RV尚可在基因内重组。目前尚无组与组之间发生基因重组的报道。

图1 轮状病毒结构图Fig.1 Structural organization of Rotavirus

2 主要的病毒蛋白

RV有11个基因片段，编码6种结构蛋白（VP1～VP4和VP6及VP7）和6种非结构蛋白（NSP1～NSP6）。其中VP1、VP2、VP3为病毒核心的结构成分，在基因转录和复制中起重要作用；VP4、VP6、VP7是病毒衣壳的主要结构蛋白，在病毒的生物学和免疫学等方面有着非常重要的功能。NSP1～NSP6在病毒复制、翻译、出芽等过程中具有重要作用。

2.1 结构蛋白 结构蛋白是形成病毒颗粒、维持病毒形态、影响病原性及免疫原性的重要蛋白。成熟的RV粒子具有3层同心的蛋白壳层：外层由糖蛋白VP7和由VP4组成的钉状物构成；中间层由260个VP6三聚体形成T=13的二十面体晶格构成；最内层主要由RNA结合蛋白VP2组成，VP2与VP1和VP3蛋白一起包装轮状病毒基因组，形成核心颗粒。

A组轮状病毒VP4是一种非糖基化的胰酶敏感蛋白，位于病毒颗粒表面，形成穗状突起，由基因组第4基因编码，分子量约为87 kDa。VP4约占病毒蛋白量的1.5%，由775个氨基酸组成，但动物RV分离株的VP4常为776个氨基酸[14]。VP4在细胞吸附和穿透中具有重要作用，使病毒具有致病性；VP4是病毒主要交叉中和抗原，自然感染时能够刺激机体产生中和抗体；VP4还是病毒结合宿主细胞受体的病毒蛋白，直接决定了病毒的毒力[15]。VP4由蛋白水解酶和糜蛋白酶连续分解产生了同质的VP8*和VP5核心（VP8CT、VP5CT），分子量分别为60 kDa和28 kDa，二者在提高病毒传染性，诱导构象变化和稳定穗状结构中起到重要作用[16]。其中VP8*靠近氨基端(247AA)，拥有VP4蛋白的主要抗原位点，且负责VP4血清特异性中和反应，VP8*的抗原表位位于穗状结构远端的头部。VP5*靠近羧基端(529AA)，包含了病毒融合作用的区域，负责病毒穿入过程[17]。VP8*抗体具有高度型特异性，这可能与VP8*的血凝素活性和半乳糖凝集素样折叠结构有关。而VP5*片段则在各型之间具有交叉反应[18]。VP8CT是可溶性的，主要包括β片层的单体；VP5CT形成了耐十二烷基硫酸钠单体，为交叉反应部位，这表明RV的蛋白消化作用激发了在VP4区中VP5*的重新分配[19]。基于RV外层蛋白VP4的抗原特性建立了血清分型系统，人类和动物A组轮状病毒可分为28个P型[20]。随着分子生物学在分类学中的应用，A组RV的血清型可能会进一步增加。VP4也是人与动物RV之间发生重组的主要部位之一。

VP6位于RV三层核衣壳的中层，是维持病毒颗粒稳定的主要结构蛋白。A组RV的VP6由病毒基因组6编码，分子量约45 kDa，由387个氨基酸组成，占病毒蛋白的5l%[21]。VP6是RV主要的内衣壳蛋白，由寡聚体形成三聚体而构成RV单层壳颗粒的二十面体表面结构。VP6的功能性区域为105～328位氨基酸，其中122～147位氨基酸为主要的聚合区域。VP6无多聚酶活性，但病毒缺乏VP6时可使病毒丢失转录酶活性[22]。VP6是RV组共同抗原和亚组特异性抗原，这也是RV分组依据所在[23]。

VP7占病毒蛋白总量的30%。依毒株不同，VP7可由病毒基因组的基因7、8或9编码。分子量36 kDa左右，由297或326个氨基酸组成[24]。VP7编码区有978个碱基，含有2个翻译起点，上游为弱启动子，下游为强启动子[25]。VP7是一种糖基化蛋白，含2个左右N型糖基化位点，是一种膜内蛋白，通过其第51～61和61～111位氨基酸固定于内质网膜上，并与VP4和NSP4形成多聚体，在病毒核心出芽时装配到病毒表面[26]。VP7构成病毒三层的最外光滑层，是轮状病毒最主要的外衣壳蛋白和中和抗原，具有CTL识别的抗原决定簇，对于保护性免疫尤为重要，且VP7基因与致病性无关。Dyall-Smith等[27]通过抗单克隆抗体突变和测序技术在轮状病毒SA11株VP7蛋白上鉴定出3个抗原区域A（87～96 aa），B（145～150 aa）和C（211～223 aa），同时还指出抗原区A和C虽然在线性序列上距离较远，但在折叠后的VP7蛋白上的空间距离很近。进一步研究发现中和抗原区域位于两个可变区87～101aa和208～221aa序列上[28]。VP7还是Ca2+结合蛋白，Ca2+对轮状病毒外壳蛋白的稳定和病毒的成熟至关重要。完整的病毒颗粒倾向形成三层颗粒，螯合剂剥夺Ca2+后，可导致成熟的轮状病毒颗粒失去VP4和VP7而形成具有转录活性的双层颗粒[29]。VP7能通过与VP4相互作用而影响VP4与细胞受体的结合效率，从而影响轮状病毒的复制效率。根据VP7抗原特性可将RV分为20个G血清型，这与P血清型相独立。同一种血清型不同株之间的VP7氨基酸序列同源性高达95%左右[30]。

2.2 非结构蛋白 RV共有6种非结构蛋白（NSP1～NSP6），分别由5、8、10、11基因片段编码，具有影响RV复制、参与其转录、组成病毒复制酶、介导病毒与靶细胞结合及形成病毒外衣壳等功能。NSP1由RV第5基因片段编码，基因片段的总长度以及开放阅读框的大小，在不同毒株间有所不同。NSP1是RV蛋白中变化最为活跃的部分，在A组RV中其序列多样性在65%以上。虽然在整体上其具有高度可变性，但在序列末端都有一个富含半胱氨酸的基序。因此NSP1被认为是可能与RV种属限制性关系最密切一种蛋白质，同时NSP1的活性会依宿主的不同而发生改变[31]。NSP1从功能上可以分为RNA结合结构域（1～81 aa）、细胞内定位结构域（82～177 aa）和效应结构域（328 aa～C末端）。其N端的RNA结合结构域中还包括一个锌指结构域（RING，42～79 aa），其可以与RV的dsRNA结合，在蛋白酶依赖的IRF3等的降解过程和NSP1稳定性的自动调节方面发挥重要作[32]。N-末端是保守区域，当锌指结构域中组氨酸和半胱氨酸发生点突变时，IRF3等的降解将发生中断，因此锌指结构的完整性对于蛋白酶依赖的IRF3等的降解过程至关重要[33]。细胞内定位结构域决定NSP1在宿主细胞的细胞骨架中聚集的位置[34]，而效应结构域可以和干扰素调控因子家族结合[35]。NSP1具有E3泛素连接酶的功能，它能诱导蛋白酶介导的干扰素调节因子IRF3、IRF5和IRF7降解，抑制Ⅰ型干扰素的反应[36]。另外，NSPl蛋白还可通过降解β-TrCP进而抑制核转录因子(NF-κB)的活化[37]，以及抑制信号转导和转录激活因子STAT1和STAT2核转位等机制对抗IFN信号传导通路[38]，从而起到抵抗宿主天然免疫反应的功能。此外，Bagchi等[39]还发现，NSP1可通过抑制感染细胞过早凋亡而促进感染后病毒生长，这也体现了RV的生存策略。

NSP3是一种多功能蛋白，大多由第7基因片段编码，通常由313个氨基酸残基组成，相对分子质量约34 kDa，呈弱酸性，为非糖基化蛋白。其N端为RNA结合区，中间为寡聚化区，C端为真核翻译起始因子eIF4GI结合区。NSP3的羧基末端可与真核生物翻译起始因子eIF4GI相互作用，寡聚化区可与RoXaN（轮状病毒NSP3相关X蛋白）结合[40]。在感染最初阶段，NSP3在轮状病毒引起的细胞蛋白质合成关闭现象中发挥重要作用。这一抑制作用可能与NSP3作为真核细胞PABP [poly(A)结合蛋白]的结构类似物而与eIF4GI竞争性结合有关，表明NSP3可能在RV复制和形态发生中起重要作用。Mentero等[41]应用RNAi抑制了NSP3在RV感染细胞中的表达，结果发现病毒蛋白的合成没有降低，病毒mRNA合成增加，并且病毒子代产量增加，因此认为NSP3对于病毒mRNA的翻译不是必需的。

NSP5蛋白由基因片段11编码，位于病毒质粒中，分子量为26 kDa。NSP5氨基酸序列高度保守，C末端是最保守的区域，这一区域也是NSP5多聚化结构域。NSP5多聚化结构域富含丝氨酸和苏氨酸，翻译后经过磷酸化和糖基化修饰。不同翻译后修饰使NSP5具有不同的分子量(26～35 kDa)，但在病毒感染的细胞中NSP5主要以26 kDa或28 kDa两种形式存在[42]。在被感染的细胞中可发现多磷酸异构体，有研究证明NSP5具有自磷酸化酶活性。Afrikanova等[43]的研究发现在细胞中瞬时表达NSP2和NSP5可以使NSP5获得高磷酸化状态，而NSP5单独在细胞中表达时无法实现高磷酸化。有些研究还显示NSP5的磷酸化与细胞的激酶和磷酸酶有关[44]。NSP5形成较早，出现在病毒质内。采用小分子RNA干扰技术研究发现，阻断NSP5的形成，即可抑制病毒质的形成和病毒的复制[45]。另外，NSP5也可与其他NSP相互作用。NSP2和NSP5已被证明是毒质体形成所必须的，并共同表达于未受感染的细胞，形成毒质体样结构。RV基因组的复制和包装，在毒质体样结构中进行。毒质体样结构在感染过程中形成，涉及多个组成部分并相互协调作用，其中NSP2和NSP5起重要作用[46]。

对轮状病毒的研究始于20世纪60年代，随着病毒检测技术和分子生物学的不断进步，我们对轮状病毒的认识亦逐渐明晰。从微观形态的观察到病毒基因组结构功能的测定，从病毒蛋白抗原特性到病毒逐个结构蛋白和非结构蛋白的研究，无不体现出科学研究从感性认识到理性认识的发展过程。随着实践的不断深入，轮状病毒的本质也将进一步为人们所揭示。

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