免疫鸡群H5N1和H9N2亚型禽流感病毒混合感染及H9N2亚型病毒进化分析

曾嘉梅，房 栋，卞学兵，王俊桦，颜 焰，周继勇,2

（1.浙江大学 农业部动物病毒学重点实验室，杭州 310058;

2.浙江大学 传染病诊治国家重点实验室，杭州 310003）

禽流感病毒（Avain influenza virus, AIV）属于正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒，基因组为8节段单股负链RNA。根据禽流感病毒囊膜表面糖蛋白HA和NA抗原性的不同，可将禽流感病毒分为16个HA亚型和9个NA亚型[1,2]。基因重组是流感病毒逃脱宿主已经获得的免疫从而造成流行的重要方式，如1957年（A/H2N2）、1968年（A/H3N2）、1997年（A/H5N1） 和 2009年（A/H1N1）的流感大爆发[3-5]，而流感病毒的混合感染是实现其基因重组的有效途径，不同亚型的流感病毒共同感染同一个宿主，它们在复制增殖时基因组可发生片段交换，从而产生出致病力不可预测的新型病毒，为流感病毒的大流行提供可能。

近年来，国内外多次报道流感病毒混合感染人的病例，但家禽混合感染事件报道甚少，本研究旨在分析免疫鸡群H5N1和H9N2亚型禽流感病毒混合感染后基因组变化，以了解混合感染中有无分子特征的改变，为预防和控制禽流感的流行提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 SPF鸡胚与标准血清 SPF种蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；鸡H5N1高免血清（HI=9log2）由中国农科院哈尔滨兽医研究所陈化兰研究员馈赠；其他H1～H13标准阳性鸡血清由中国农业大学动物医学院刘金华教授惠赠。

1.2 病料来源 病死鸡肺组织来源于浙江省余姚市禽病防治研究所。调查中，鸡群发病前免疫接种针对H5N1禽流感病毒的Re-4和Re-5疫苗及针对H9N2病毒的F株疫苗，三免后鸡群H9N2和H5N1抗体水平均高于6log2。

1.3 引物合成与RT-PCR检测 根据GenBank数据库中禽流感病毒的HA和NA序列，在保守区设计鉴别H5N1和H9N2亚型的特异性引物（表1），引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。取肺组织按1:3（V/V）加入MEM后进行匀浆，组织匀浆经120 000×g离心15 min后取上清，使用Trizol LS Regent（Invitrogen公司）提取RNA，参照Fermentas Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit操作说明，使用Uni12引物通用引物（5'-AGCAAAAGCAGG-3'）进行反转录，将得到的cDNA通过特异性引物进行PCR扩增以鉴定亚型。

表1 禽流感病毒亚型鉴定引物Table 1 Primers for subtype identify of Avian inf l uenza virus

1.4 病毒分离 病死鸡肺组织匀浆上清与等量的H5N1禽流感病毒高免血清混合后，放于4 ℃冰箱中和过夜，接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.2 mL，观察鸡胚死亡时间，96 h内未死亡的鸡胚4 ℃冷冻收胚。收集鸡胚尿囊液，用不同亚型禽流感病毒血清进行血凝抑制试验。

1.5 基因片段的克隆及其测序 使用禽流感病毒基因组特异性引物（表2），PCR扩增H9N2病毒的全基因组片段，PCR产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒（Axygen公司）回收后，连接至pMD18-T载体（TaKaRa公司），连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆送至上海博尚生物技术有限公司测序。

1.6 序列分析 应用Omiga软件分析序列，推导编码的氨基酸序列，应用Clustalx软件比对得到的序列，应用MEGA 5.0软件绘制各基因的系统进化树。

2 结果与讨论

2.1 混合感染的RT-PCR检测 取肺组织病料上清提取病毒总RNA，经反转录后，使用流感病毒H1-H16和N1-N9的亚型特异性引物进行病毒亚型鉴定，PCR显示扩增出H5A、H9A、N1A和N2A片段（图1），再将4个PCR产物送至上海博尚生物技术有限公司测序。测序结果表明，病料中含有H5N1和H9N2亚型的HA和NA基因片段，说明病料含有H5N1和H9N2亚型禽流感病毒。经NCBI Blast比对，H5A片段序列与A/oriental magpie robin/Hong kong/9298/2009毒株的同源性最高，为98.6%，进化分析显示混合感染病毒中H5N1毒株属于clade 2.3.2。

表2 H9N2亚型流感病毒基因组扩增引物Table 2 Primers for amplif i cation of the eight genes of H9N2 subtype Avian inf l uenza virus

图1 病料HA和NA基因的RT-PCR扩增Fig.1 RT-PCR amplif i cation of HA and NA genes for AIV

2.2 病毒分离与鉴定 取病料上清与等量的H5N1亚型禽流感病毒高免血清混合后，置于4 ℃冰箱中和过夜。病料接种SPF鸡胚36 h后出现鸡胚死亡，死亡鸡胚的尿囊液能凝集鸡的红细胞。血凝抑制试验结果显示，分离病毒的血球凝集特性能被禽流感病毒的H9亚型阳性血清抑制，而不被其他亚型的禽流感病毒阳性血清抑制，使用分子生物学方法采用流感病毒亚型鉴定引物，PCR只扩增出H9A和N2A片段（图2），表明所分离的病毒为H9N2亚型禽流感病毒，命名为A/chicken/Yuyao/01/2010（H9N2）。

图2 H9N2病毒鉴定结果Fig.2 PCR identif i cation results of H9N2 virus

2.3 H9N2病毒全基因组分子特征 PCR扩增H9N2亚型禽流感病毒的全基因组片段，PCR产物经1%凝胶电泳检测，结果见图3。A/CK/YY/1/10的HA蛋白的裂解位点为PSRSSR/GL，为低致病性禽流感病毒的特征，影响HA受体结合特性的位点，183N、190A、226L、228G，其226位出现人源流感病毒结合位点[6]。A/CK/YY/1/10的NA蛋白在茎部63～65位缺失3个氨基酸，为Ck/BJ/1/94-Like谱系的毒株的特征。研究显示，流感病毒NS1蛋白中P42S、D92E和V149A这3个突变被认为与H5N1病毒在人和鸡毒力增强有关[7]，A/CK/YY/1/10的NS1蛋白在这3个位点的氨基酸分别为42S、92D和149A。此外，由于NS1核苷酸C652T的突变形成终止密码子TAG，致使NS1蛋白羧基端缺失了13个氨基酸，缺失了ESEV序列，进而失去了PDZ蛋白结合能力。流感病毒M2蛋白中的V27A和S31N的突变被认为是与流感病毒抵抗金刚烷胺密切相关[8]，A/CK/YY/1/10的M2蛋白26～34位氨基酸为LVVAANIIG，其31位发生了S31N的突变，27未有V27A的突变，表明其对金刚烷胺的抵抗能力有所增强。流感病毒PB2蛋白中E627K和D701N的突变被认为与禽流感病毒适应哺乳动物及其增强其对哺乳动物的感染能力和致病性有关[9]，A/CK/YY/1/10的PB2蛋白在这两个位点分别为627E和701D。

图3 H9N2病毒的全基因组片段Fig 3 RT-PCR products of H9N2 genome

2.4 H9N2病毒各基因的进化分析 参照Guan等[10]对H9N2亚型禽流感HA基因的分类标准，可以分为北美谱系和欧亚谱系，其中欧亚谱系又可以细分为3个谱系，分别以A/Chicken/Beijing/1/94、A/Quail/Hong Kong/G1/97和A/Duck/Hong Kong/Y439/97为代表毒株。A/CK/YY/1/10属于A/Chicken/Beijing/1/94-Like谱系（图4），这一谱系是近十年来中国地区的主要流行毒株，此病毒与 A/chicken/Zhejiang/HJ/2007、A/chicken/Anhui/WBQ/2011等构成一小分支，它们之间的同源性为94.5%～99.4%，而与BJ/1/94-Like谱系中其他毒株的同源性为87.2%～92.4%。依据Li等[11]对我国分离得到的H9N2病毒的进化分析结果为参照，A/CK/YY/1/10的NA、NS属于BJ/1/94-Like谱系，M、PB2属于G1-Like谱系，NP、PB1和PA属于SH/F/98-Like谱系，这些结果显示A/CK/YY/1/10为一重排病毒。

图4 H9N2毒株的 HA基因进化树Fig.4 Phylogentic tree of H9N2 HA gene

2.5 本次分离鉴定的A/chicken/Yuyao/01/2010（H9N2）的HA基因与近些年华东地区分离到的A/chicken/Zhejiang/SXY/2010（H9N2）（99.4%）、A/chicken/Anhui/WBQ/2011（H9N2）（99.4%）和 A/swine/Taizhou/5/2008（H9N2）（98.5%） 病毒株同源性很高，其内部基因除了PB2以外，均与A/swine/Taizhou/5/2008（H9N2）的同源性最高（>98%）， 但 是PB2与A/swine/Taizhou/5/2008（H9N2）的同源性较低（82.9%）。因此，A/swine/Taizhou/5/2008（H9N2） 可 能 为 A/CK/YY/01/10提供了除PB2以外的大部分基因，结合A/CK/YY/01/10毒株的8个基因片段分别隶属于Ck/BJ/1/94-Like、Ck/SH/F/98-Like和 G1-Like三 个不同的谱系，推测A/chicken/Yuyao/01/2010（H9N2）毒株基因谱系的多样化可能是多种谱系的H9N2病毒共同感染而造成的多片段重组所致。

混合感染病毒中H5N1属于2.3.2分支， Re-4/5流感疫苗HA基因分别为第7分支和2.3.4分支，与2.3.2分支病毒具有较大差异，H9N2病毒HA基因与疫苗F株存在10.3%的核苷酸差异。调查中，免疫鸡群H9N2和H5N1的抗体水平均高于6log2，出现鸡群发生H5和H9N2亚型的混合感染，进一步表明该鸡场环境中流行的H5N1和H9N2禽流感病毒与疫苗有抗原性差异，以致免疫后不能有效抵抗野毒的感染，提示国内禽流感新型疫苗的研制刻不容缓。通过对混合感染中的H9N2病毒全基因组测序和使用RDP3.44软件[12]对H9N2病毒的基因组分析，虽然没有在混合感染的H9N2病毒中发现H5N1的基因片段，但必须对禽流感病毒的混合感染现象加以重视和警惕，以防止通过混合感染而产生新的病毒。流感病毒基因组的分节段特性为不同亚型流感病毒在共同感染一个宿主时发生基因重组产生新型病毒提供了机会。据报道，新型流感病毒的表面糖蛋白与现有宿主的免疫系统具有很弱的血清学反应[13,14]，这种抗原漂移被认为是1957年（A/H2N2）和1968年（A/H3N2）的全球流感大爆发的原因[3,4]。

[1] Webster R G, Bean W J, Gorman O T,et al.Evolution and ecology of influenza A viruses[J].Microbiol Rev, 1992,56(1): 152-179.

[2] Fouchier R A, Munster V, Wallensten A,et al.Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls[J].J Virol, 2005, 79(5): 2814-2822.

[3] Li K S, Guan Y, Wang J,et al.Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia[J].Nature, 2004, 430(6996): 209-213.

[4] Neumann G, Chen H, Gao G F,et al.H5N1 influenza viruses: outbreaks and biological properties[J].Cell Res,2010, 20(1): 51-61.

[5] Garten R J, Davis C T, Russell C A,et al.Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1)influenza viruses circulating in humans[J].Science, 2009,325(5937): 197-201.

[6] Hensley S E, Das S R, Bailey A L,et al.Hemagglutinin receptor binding avidity drives influenza A virus antigenic drift[J].Science, 2009, 326(5953): 734-736.

[7] Jackson D, Killip M J, Galloway C S,et al.Loss of function of the influenza A virus NS1 protein promotes apoptosis but this is not due to a failure to activate phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)[J].Virology, 2010,396(1): 94-105.

[8] Schnell J R, Chou J J.Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus[J].Nature, 2008,451(7178): 591-595.

[9] Ping J, Dankar S K, Forbes N E,et al.PB2 and hemagglutinin mutations are major determinants of host range and virulence in mouse-adapted influenza A virus[J].J Virol, 2010, 84(20): 10606-10618.

[10] Guan Y, Shortridge K F, Krauss S,et al.H9N2 influenza viruses possessing H5N1-like internal genomes continue to circulate in poultry in southeastern China[J].J Virol,2000, 74(20): 9372-9380.

[11] Li C, Yu K, Tian G,et al.Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic poultry in Mainland China[J].Virology, 2005, 340(1): 70-83.

[12] Martin D P, Williamson C, Posada D.RDP2:recombination detection and analysis from sequence alignments[J].Bioinformatics, 2005, 21(2): 260-262.

[13] Salomon R, Webster R G.The influenza virus enigma[J].Cell, 2009, 136(3): 402-410.

[14] Smith G J, Fan X H, Wang J,et al.Emergence and predominance of an H5N1 influenza variant in China[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(45): 16936-16941.