耿 阳,牟小东,刘 然,边葶苈,廖 敏,周继勇
(浙江大学 农业部动物病毒学重点实验室,杭州 310058)
鸡的传染性支气管炎由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)感染引起,是一种高度接触性传染病,IBV可侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统、消化系统及生殖系统等[1]。由于IBV特殊的转录机制导致该病毒容易发生变异,造成的临床特征越来越复杂。目前IBV的变异株广泛分布于世界各地,给养禽业带来严重的经济损失。
传染性支气管炎病毒与引起严重急性呼吸综合症(severe acute respiratory syndrome,SARS)的冠状病毒(SARS-coronary virus, SARS-CoV)同属于冠状病毒科冠状病毒属的成员。这两种病毒具有相似的基因组结构,其基因组编码四种结构蛋白:纤突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和15或16种非结构蛋白(nonstructural protein),在IBV没有nsp1蛋白[2]。已有的研究表明,冠状病毒的非结构蛋白与病毒的复制、增殖和致病力有关[3-6]。
nsp5是冠状病毒的主要蛋白酶(main protease,Mpro), 又称 3C样 蛋白酶(3C-like proteinase,3CLpro),对多聚蛋白的水解起关键作用,因此,nsp5成为抗SARS和其他冠状病毒药物研究的重要靶点[7]。目前对IBV非结构蛋白的研究几乎是一片空白,开展IBV非结构蛋白研究对于揭示IBV的致病机制和寻求IBV新的检测方法具有重要意义。本试验利用基因工程技术重组表达了IBV nsp5蛋白,并证实其具有良好的免疫原性和反应原性。
1.1.1 病毒、细胞及宿主菌 传染性支气管炎病毒SC021202毒株[8]、Sf9细胞、E.coliTOP10、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、E.coliDH10Bac由本实验室保存。
1.1.2 载体与试剂 杆状病毒表达载体pFastBac HTA、CellfectinⅡ转染试剂以及TRIzol试剂购自Invitrogen公司;反转录试剂盒购自Fermentas公司;T4 DNA连接酶及限制性核酸内切酶购自TaKaRa公司;DNA凝胶回收试剂盒购自于AxyGen公司;Ni-NTA亲和纯化试剂盒购自QIAGEN公司;鼠抗His单克隆抗体由本实验室制备并保存;兔抗GST多抗血清、HRP标记羊抗鼠IgG以及HRP标记羊抗兔IgG均购自于KPL公司。
1.2.1nsp5基因的扩增 根据IBV SC021202的基因组序列(GeneBank 登录号: EU714029),设计扩增IBV SC021202nsp5上下游引物:IBVnsp5-F,5′-GGAATTCGCTGGTTTTAAGAAGCTAGTT TC-3′;IBVnsp5-R,5′-AGCGTCGACTCACTGT AGTCTGACAC-3′,引物分别带有EcoR I和SalI酶切位点。以Trizol试剂从IBV SC021202感染的鸡胚尿囊液中提取的RNA为模板反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR反应,PCR程序:95 ℃预变性4 min;然后进入94 ℃变性1 min,58℃退火30 s,72 ℃延伸1 min的循环,共进行30个循环;72 ℃再延伸6 min。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后,用试剂盒进行纯化回收目的基因片段。将回收到的基因片段连接到pMD18-T质粒载体、转化TOP10感受态细胞,经PCR和限制性内切酶分析后送测序公司进行目的片段的测序分析,确定目的基因片段扩增的正确性。将序列测定正确的重组T质粒命名为IBVnsp5-T。
1.2.2 重组表达载体的构建 纯化回收经EcoR I和SalI酶切载体IBVnsp5-T的目的基因片段连接到经EcoR I和SalI酶切的pFastBac HTA转移载体,转化TOP10感受态细胞,经PCR和酶切分析正确的阳性重组转移载体pFastBac HTA-IBVnsp5转化含有杆状病毒基因组Bacmid的E.coliDH10Bac感受态细胞,使转移载体与杆状病毒基因组发生同源重组。在选择性LB平板(含50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL庆大霉素、10 μg/mL四环素、100 μg/mL X-gal和40 μg/mL IPTG)上进行蓝白斑筛选。挑取白色克隆经LB培养基培养后,提取质粒DNA,分别用特异性引物和M13通用引物(M13上游引物:5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3';M13下游引物:5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'),PCR鉴定带目的片段阳性克隆。获得的阳性质粒命名为IBVnsp5-Bacmid。同样方法构建增强型绿荧光蛋白(enhanced green fluorescene protein,EGFP)重组质粒EGFP-Bacmid作为参照。
1.2.3 重组蛋白表达 参照Invitrogen 公司CellfectinⅡ转染试剂说明书操作方法。将IBV nsp5-Bacmid和EGFP-Bacmid质粒同时分别转染Sf9细胞,待在荧光显微镜下可以观察到大量绿色荧光蛋白表达时收集IBVnsp5-Bacmid质粒转染细胞上清液作为P0代重组病毒。P0代毒在Sf9细胞中传代2次后,用间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)鉴定传代过程中目的蛋白的表达情况,并收获上清作为重组病毒于4℃保存,备大量接种细胞用。
1.2.4 重组蛋白鉴定 收获重组杆状病毒感染72 h后的Sf9细胞,经PBS洗涤3次后,用适量的PBS悬浮细胞,超声波裂解细胞后,加入等体积的2 ×SDS-PAGE上样缓冲液进行SDS-PAGE,转膜后,以抗His单抗作为一抗,HRP标记的抗鼠IgG为二抗,按常规的Western blot检测表达的蛋白。
1.2.5 重组蛋白的纯化 重组杆状病毒原液与Sf9细胞感作1 h后,弃去病毒液,加入新鲜培养液继续在37 ℃下孵育3~4 d后收获细胞。按QIAGEN公司蛋白纯化试剂盒纯化His融合蛋白的方法纯化重组蛋白。纯化后的蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。用BCA蛋白检测试剂盒(Pierce Biotechnology)测定蛋白的浓度。
1.2.6 抗nsp5小鼠多抗血清的制备 纯化的重组蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合,充分乳化,按100 μg/只蛋白的量经腹腔免疫6~8周龄BALB/c小鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)。此后每隔2周,相同的蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化后,以相同的剂量和方法加强免疫。免疫4次后,采血分离血清,通过IFA、(enzyme linked immunosorbene assay, ELISA)、Western blot鉴定抗体的产生。
图1 nsp5基因的RT-PCR扩增Fig.1 Amplif i cation of nsp5 gene by RT-PCR
1.2.7 IBV感染细胞中nsp5蛋白的IFA检测 IBV SC021202毒株感染96孔板培养的DF-1细胞48 h后,用4%甲醛固定30 min。经含5%脱脂奶粉的PBS封闭1 h后,用1:100稀释的抗nsp5的小鼠多抗血清与细胞于37℃孵育1 h,之后再用1:500稀释的FITC标记的抗鼠IgG于37℃孵育1 h。反应结束后荧光显微镜观察并记录结果。设未感染的DF-1细胞作对照。
2.1 nsp5基因的扩增、克隆与重组质粒的鉴定 以IBV SC021202 毒株感染的鸡胚尿囊液抽提的RNA为模板,以IBVnsp5-F和IBVnsp5-R为引物,RT-PCR扩增出约900 bp的片断(图1)。将该片断连接到pMD18-T载体,经测序证明为921bp的IBV nsp5基因。
将纯化获得的nsp5亚克隆于杆状病毒表达系统的pFastBac HTA载体,获得重组转移载体pFastBac HTA-IBVnsp5。此重组转移载体转化含有杆状病毒基因组Bacmid的E.coliDH10Bac感受态细胞,通过同源重组获得杆状病毒重组质粒IBVnsp5-Bacmid。构建好的重组质粒转化相应E.coli后,挑取单菌落培养后,提取重组质粒,经酶切、PCR和测序鉴定,表明nsp5基因插入的位置、大小和阅读框均正确。图2为重组质粒PCR鉴定结果。同样的方法也成功构建了作为参照用的EGFP重组质粒(数据未显示)。
图2 重组质粒的PCR鉴定Fig.2 Identif i cation of recombinant plasmids by PCR
2.2 重组杆状病毒的获得及表达蛋白的纯化和鉴定将IBVnsp5-Bacmid转染Sf9细胞,同时EGFPBacmid也染转Sf9细胞作为插入基因蛋白表达的参照。转染的细胞培养上清作为传代病毒在Sf9细胞传2代后,再接种Sf9细胞,接毒后72 h,在显微镜下观察到明显的细胞病变。通过参照的重组EGFP杆状病毒感染Sf9细胞的观察,可见在转染后12 h有微弱荧光,转染24 h后荧光稍有加强,转染48 h后可见荧光信号明显加强,等到转染96 h后,大约70%细胞内可见到较强的绿色荧光(图3A)。
根据EGFP表达的情况,IBVnsp5-Bacmid转染细胞获得的重组杆状病毒接种Sf9细胞后96 h收获感染的细胞。收获的细胞固定后,以His单抗作为一抗,通过IFAT检测感染细胞中目的蛋白的表达。结果观察到IBVnsp5-Bacmid接毒的Sf9细胞出现了明显的荧光反应,而未接毒的Sf9细胞无荧光反应,表明IBVnsp5-Bacmid转染的Sf9细胞成功表达了His/His融合蛋白(图3B)。
为了进一步确定重组病毒感染的细胞表达了重组的目的蛋白,将收获的IBVnsp5-Bacmid重组病毒感染的Sf9细胞用超声波裂解后,裂解产物进行SDS-PAGE电泳,转膜后经Western blot检测,结果裂解产物与His单抗起特异性反应,并在37 kDa左右的位置出现了反应带(图3C),与预期的His和nsp5融合蛋白的分子量大小相符,说明了nsp5在Sf9获得了顺利表达。
利用融合蛋白带有His标签的特性,从感染细胞中纯化了重组蛋白,纯化的重组蛋白大小为预期的37 kDa左右(图4A),并与His单抗发生反应(图4B)。
图3 nsp5真核表达及鉴定Fig.3 Expression and identif i cation of nsp5 expressed in Sf9 cells
图4 nsp5蛋白真核表达Fig.4 Expression of nsp5 in Sf9 cells
2.4 nsp5天然蛋白的检测 IBV SC021202毒株感染DF-1细胞后,用纯化的重组蛋白制备的nsp5多抗血清通过IFAT检测感染的DF-1细胞是否表达天然的nsp5蛋白。结果可观察到感染了IBV SC021202的DF-1细胞中出现了明显的绿色荧光(图5)。表明制备的抗血清可与天然的nsp5蛋白有良好的反应性。
图5 nsp5天然蛋白IFAT检测Fig.5 Detection of native nsp5 by IFAT
本研究选取高效的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了IBV的nsp5蛋白,在构建nsp5重组病毒的同时也构建EGFP重组病毒作为指示系统。EGFP的表达能容易通过荧光显微镜观察到。EGFP成功表达一方面指示同时进行的目的基因的操作系统可行,另一方面,通过EGFP重组病毒感染细胞后的病变和蛋白表达情况也可以给nsp5重组病毒和感染细胞收获时间以及表达蛋白检测时间作参考。通过IFAT检测发现,nsp5重组病毒感染的细胞与EGFP重组病毒感染的细胞类似,在感染96 h后,大部分的细胞都表达了目的蛋白,而且此时收获细胞纯化蛋白获得的量也比较高。Western blot在鉴定感染细胞裂解物的蛋白时,出现两条约37 kDa左右的反应带,可能是表达蛋白被糖基化,造成蛋白在SDS-PAGE胶中迁移率差异的结果。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统能在真核细胞表达与天然蛋白结构接近的重组蛋白[9]。我们在真核细胞成功表达nsp5前,用原核系统表达了nsp5蛋白,但原核表达的蛋白制备的抗血清不能顺利检测到感染细胞的天然nsp5蛋白,而本研究中真核表达的蛋白制备的抗血清可检测到天然的nsp5蛋白,表明了Bac-to-Bac表达系统的优越性。nsp5在Sf9细胞的成功表达和纯化为进一步研究nsp5的生物学功能奠定了基础。目前对冠状病毒nsp5的研究多集中在SARS冠状病毒,小鼠肝炎病毒(MHV)等冠状病毒的生物信息学、蛋白晶体结构及其与其他蛋白相互作用的研究上[10,11]。对IBVnsp5蛋白功能的进一步研究可为SARS冠状病毒等的研究提供借鉴。
目前在对IBV的基因分型、诊断以及致病机制研究等方面,主要基于对IBV的结构蛋白尤其是S1基因的研究上。很少见到有应用IBV的非结构蛋白建立IBV诊断方法的报道。然而相对于S1基因,非结构蛋白在不同的IBV变异株间更保守。序列分析表明IBV nsp5与经典呼吸型毒株M41、H52以及肾型株SAIBK的氨基酸的同源性在90%~94%之间(数据未显示)。因此,建立基于非结构蛋白的检测方法对IBV的检测更具普遍性。本文纯化的蛋白制备的血清不仅与重组的nsp5蛋白起反应,而且能检测到IBV感染细胞中特异的nsp5蛋白,表明nsp5蛋白具有良好的免疫原性和反应性,可用于IBV抗原或抗体检测方法的建立。
综上所述,本文利用真核系统成功表达了nsp5蛋白,为病毒诊断抗原、抗体的开发以及nsp5蛋白的生物学研究提供了物质基础。
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