血管内皮生长因子D在肌肉瘤小鼠模型中的表达

姚立杰，金海峰，马勇，谢立平

（齐齐哈尔医学院解剖教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

肌肉瘤是起源于横纹肌细胞或向横纹肌细胞分化的间叶细胞的一种恶性肿瘤，为儿童软组织肉瘤中最常见的一种，少发生于成人，男性较女性多见，其恶性程度较高。横纹肌肉瘤易发生区域淋巴结转移和血道转移，文献报道区域淋巴转移率为15%～25%，血道转移率可超过50%，而肿瘤的生长、侵袭和转移依赖于血管和淋巴管的生成。近年的研究表明，血管内皮生长因子家族在肿瘤转移过程中起重要作用，血管内皮生长因子D（vascular endothelial growth factor D，VEGF-D）是最近发现与淋巴管生成及肿瘤淋巴道转移有关的因子。本实验通过用S180肉瘤小鼠癌性腹水在小鼠臀部肌层种植，获得稳定的S180肉瘤动物模型［1］，用淋巴管内皮透明质酸受体 1（lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1，LYVE-1）作为淋巴管标记物［2］，观察横纹肌肉瘤中VEGF-D促进淋巴管生成的作用，为临床抗淋巴管生成、治疗肿瘤提供有效的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物、肿瘤细胞及主要试剂

健康昆明小鼠，雌雄不分，体质量18～20 g，由黑龙江省哈尔滨医科大学附属二院动物实验中心提供。瘤株为S180肉瘤小鼠腹水型，由黑龙江省肿瘤防治研究所提供，经小鼠腹腔接种传代接种并于-70℃冰箱冻存备用。LYVE-1（H-156）多克隆抗体和VEGF-D（X142）单克隆抗体（Santa Cruz公司），DouSP免疫组化双染试剂盒和多聚赖氨酸（福州迈新生物技术开发有限公司），SuperECL Plus超敏发光液（北京普利莱基因技术有限公司）。

1.2 动物模型的制备和标本处理

取S180荷腹水瘤小鼠，消毒腹部，无菌抽取腹腔液。在每只健康小鼠左下肢外侧臀部肌层和内侧肌层分别注射0.2 mL癌性腹水，共注射30只。接种1周后，可见明显肿物形成。接种第1周后处死小鼠，取肿瘤组织与瘤周组织（作为对照），常规石蜡包埋切片，HE染色，观察肿瘤及瘤周组织淋巴管和血管。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组织化学染色检测小鼠肉瘤组织中VEGF-D的表达：待测的新鲜组织浸入4%多聚甲醛，4℃冰箱保存，石蜡包埋，常规4 μm连续切片，阻断内源性过氧化物酶的活性，滴加一抗（VEGF-D浓度 1∶400，LYVE-1浓度 1∶600），湿盒中孵育，4℃过夜，滴加即用型生物素化二抗，其余严格按试剂盒说明书操作。光镜下观察结果。结果判断：阳性显色为蓝黑色。每张切片计数3个高倍视野（×400），每个视野计数100个细胞，结果取均数表示。以阳性细胞数>25%为阳性判断标准。

1.3.2 Western blot检测小鼠肉瘤组织中VEGF-D的表达：检测小鼠肌肉瘤组织中VEGF-D及LYVE-1表达。取待测新鲜组织（包括肌肉瘤组织、瘤周组织、対侧正常组织）50 mg，用组织小剪刀剪碎（在冰盒中操作），加入适量的细胞裂解液，超声粉碎，离心，用Lowry法测蛋白总量。加样15～20 μL，进行SDSPAGE凝胶电泳；转膜（70 V，1.5 h）；用丽春红染色，2～3 min后用1×TBS冲洗，分清条带，做好标记，杂交；滴加一抗（1∶400）孵育，4℃过夜；滴加二抗（1∶5 000）孵育，摇床 2 h；暗室内 ECL反应（避光），X线片显影，定影；扫描蛋白印迹条带。

1.4 统计学处理

所有数据均用SPSS 10.0统计软件处理，计量资料用±s表示，组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察

接种癌性腹水的小鼠，接种后第5天可触及肿块，1周后肿块明显变大，且与皮肤与深部组织发生粘连，无真正包膜，切面较松软，灰白或灰红色鱼肉样。成瘤率100%。

2.2 HE染色后光镜下观察

镜下可见瘤体周围正常横纹肌组织被瘤细胞破坏，较多管状结构散在其中。细胞呈梭形、星形、卵圆或椭圆形，排列稀疏，有丰富的黏液基质，核分裂较多。可见纵行的肌原纤维或横纹（图1）。

2.3 免疫组化染色切片观察

VEGF-D主要表达在肌肉瘤组织，在癌巢周围的微脉管中也可见其阳性表达（经LYVE-1染色证实主要是微淋巴管），见图2。30例肌肉瘤小鼠模型中后肢内、外侧的肌肉瘤组织中VEGF-D的阳性表达（19例）明显高于后肢内侧（11例）、外侧（8例）的瘤周组织（P<0.01）；后肢内、外侧的瘤周组织比较VEGF-D表达的差异无统计学意义（P＞0.05）。非肿瘤种植侧正常横纹肌组织无VEGF-D表达（图3）。

2.4 Western blot检测VEGF-D的表达

Western blot分析显示，30例肌肉瘤小鼠模型中肌肉瘤组织VEGF-D的表达（VEGF-D/β-actin光密度比值 1.903 6±0.045 3）明显高于后肢内侧（VEGF-D/β-actin 光密度比值 0.578 9±0.043 6）、外侧（VEGF-D/β-actin光密度比值 0.620 4±0.109 9）的瘤周组织（P<0.05），后肢内、外侧的瘤周组织比较，VEGF-D表达的差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

3 讨论

在小动物肿瘤模型的研究中，S180肉瘤建株最初应用于腹水肿瘤模型的研究，随后作为移植性肉瘤模型逐渐在NH（昆明）小鼠、Balb/C小鼠、ICR小鼠等各品系小鼠中得到应用，说明S180肉瘤种系差异小，适应性广。本实验选择S180肉瘤小鼠癌性腹水，在小鼠臀部肌层种植，获得稳定的S180横纹肌肉瘤动物模型。观察其生长规律，结果表明该动物模型复制方法简单，成功率高，性质稳定，实验周期短，可控性好，是理想的小动物肉瘤实验模型［1］。

VEGF-D是1996年首先由Orlandini等从鼠的完全缺失c-fos基因的成纤维细胞中分离提取的，1998年由Achen在核酸数据库中通过基于计算机的同源性搜索，确认了这个VEGF家族中的新成员，并将其命名VEGF-D［3］。LYVE-1只表达在淋巴管内皮上，在血管内皮、肿瘤细胞都无表达，作为淋巴管的特异性标记物更为准确。因此本研究中采用了LYVE-1（H-156）多克隆抗体对横纹肌肉瘤组织内的淋巴管进行标记，结果显示，标记的管腔多呈扩张状，形态不规则，壁薄，管腔内未见红细胞，也有呈闭锁的条索状或几个内皮细胞构成的细胞簇，甚至单个内皮细胞。通过对30例横纹肌肉瘤组织内淋巴管分布部位的观察，横纹肌肉瘤组织中心区和边缘区均存在淋巴管，淋巴管的数量明显增加，这预示着横纹肌肉瘤组织中存在淋巴管的增生和新生，淋巴管的增生和新生可能与VEGF-D的诱导密切相关。本研究结果表明，VEGF-D是促进横纹肌肉瘤淋巴道转移的重要因素之一，相信随着对VEGF家族研究的深入，将为肿瘤的抗转移治疗进而提高患者的生存率开辟新的方向［4，5］。

［1］汤宇，崔雪梅，袁玫，等.小鼠移植性S180肉瘤模型的建立及温和加热对热休克蛋白70表达的影响［J］.中国矫形外科杂志，2004，12（10）：768-770.

［2］张卫东，赵玲辉，张雅芳，等.胃癌组织淋巴管LYVE-1、钙粘蛋白的表达及其与癌转移的关系［J］.中国临床解剖学杂志，2006，24（2）：170-172.

［3］刘宝全，张雅芳，马晶，等.血管内皮生长因子D和血管内皮生长因子受体3在人结肠癌中的表达及淋巴道转移中的作用［J］.解剖学报，2007，38（1）：56-60.

［4］Lee YK，Shanafelt TD，Bone ND，et al.VEGF receptors on chronic lymphocytic leukemia（CLL）B cells interact with STAT 1 and 3：implication for apoptosis resistance［J］.Leukemia，2005，19（4）：513-523.

［5］Jia H，Bagherzadeh A，Hartzoulakis B，et al.Characterization of a bicyclic peptide neuropilin（NP-1）antagonist（EG3287）reveals importance of vascular endothelial growth factor exon 8 for NP-1 binding and role of NP-1 in KDR signaling ［J］.Biol Chem，2006，281（19）：13493-13502.