EPO对糖尿病兔心肌梗死后心肌重塑基质金属蛋白酶表达的影响

樊国亮，修宗谊，谷天祥，姜德哲，张敏，马瑞阳

（1.泰达国际心血管病医院，天津 300457；2.中国医科大学附属第一医院心脏外科，沈阳 110001）

心肌在高血糖状态下可发生纤维化，加之心肌缺血，坏死后纤维化会进一步加剧，进而出现心肌同步运动消失、心室重构、心力衰竭甚至死亡。近年来糖尿病合并冠心病心肌梗死的患者逐年增加，严重威胁人类生命和健康，减少缺血坏死区心肌纤维化是减轻心室重构的重要措施。近年来临床和实验研究发现，促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是心脏保护因子，为能更接近临床并指导实际工作，我们设计了该实验。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取40只健康日本大耳兔（中国医科大学试验动物部提供），兔龄5～6个月，体质量2.5～3.0 kg，雌雄不拘，动物合格证号为scxk（辽）2003-0009。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。

1.2 实验方法

1.2.1 糖尿病模型的建立：适应环境的健康兔，禁食12 h经耳缘静脉采用2次法注射四氧嘧啶（ALX），按50 mg/kg，间隔1周后再按100 mg/kg注射ALX，注射后即刻50%葡萄糖5 mL灌胃，采用葡萄糖氧化酶法测末次给药后检测24和72 h的空腹血糖值，以至少1次空腹血糖≥16.7 mmol/L为建模成功。糖尿病模型建立饲养1个月存活30只，随机数字法分为3组：假手术组（A组）、手术对照组（B组）、手术用药组（C组）。

1.2.2 急性心肌梗死模型建立：禁食12 h，采用速眠新1 mL/kg肌肉注射，10%水合氯醛1 mL/kg腹腔注射麻醉，固定实验动物于兔台，连接心电图，于第Ⅲ、Ⅳ肋间进胸，逐层分离，小开胸器撑开，切开心包，辨别冠脉血管，B、C组暴露前降支，在第一对角支分出后2～3 mm以5-0无创线进针2～3 mm，冠状动脉结扎成功标志为Ⅱ导联心电图ST段抬高、局部心肌变暗红、节段运动不良；A组相应冠状动脉处穿线不结扎。抽气关胸，连续3 d肌肉注射青霉素80万U/d。

1.3 给药

C组AMI术后即刻给药将EPO（上海麒麟鲲鹏生物药业提供）按1 000 U/kg，隔1周再给予相同剂量。A、B组注射相应剂量生理盐水。

1.4 标本采集及观察指标

C组注射EPO后2周，A、B组术后2周采静脉血行血常规检查血红蛋白含量。1个月后全麻后迅速取心脏，TTC染色，甲醛固定石蜡包埋，Masson染色、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、组织型基质金属蛋白酶抑制剂1（tissue inhibitor of metallo proteinase-1，Timp-1）免疫组化染色光镜下图像分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，多组比较采用方差分析，2组比较用t检验。数据以±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

A组存活8只，B组存活9只，C组存活9只。TTC染色中可见C组心肌梗死面积较B组显著较少差异有统计学意义（P<0.05）；光镜下半定量数据分析，Masson染色及MMP-9免疫组化染色，C组较B组胶原纤维显著较少，差异有统计学意义（P<0.05）；Timp-1免疫组化染色，B组与C组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 胶原纤维、MM P-9、Timp-1表达的比较（±s）Tab.1 The com parison of col lagen fiber，M MP-9 and Timp-1（±s）

表1 胶原纤维、MM P-9、Timp-1表达的比较（±s）Tab.1 The com parison of col lagen fiber，M MP-9 and Timp-1（±s）

1）P<0.05，2）P>0.05 vs group A.

Group Masson MMP-9 Timp-1 Group A 1.82±0.24 10.81±0.25 10.57±0.19 Group B 10.98±0.401） 25.84±0.381） 23.14±0.281）Group C 7.19±1.051） 21.59±0.651） 22.80±0.542）

3 讨论

心肌间质的主要成份是胶原蛋白，其作用是维持心肌细胞的排列、协调心肌收缩性和保持左室几何形状。实验证实，高血糖状态下可出现心肌细胞、基质、微血管发生显著变化致使心肌重构。同样当心肌细胞在缺血缺氧梗死时，就会不仅表现心肌细胞的凋亡、坏死、肥大、延长和心室肌肥厚，还表现为间质纤维胶原合成和降解之间的动态平衡破坏，导致间质成分组成和量的改变，从而出现心室重塑进一步加剧，最终出现严重心力衰竭，甚至死亡。

本试验采用MMP-9作为观察指标，主要是因为MMP是一类分解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分的锌蛋白酶，以酶原形式分泌，可由蛋白酶和多种因子激活主要功能是降解除多糖外的全部细胞外基质组分，并激活其他MMP，形成瀑布效应，是调节ECM动态平衡的最重要酶系［1］。按其作用的底物不同可分为胶原酶、明胶酶、基质溶解素及膜型 MMP（membrane type MMP，MT-MMP）。研究证实在心肌梗死后重构期间，心脏 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9 的活性和表达都有增加［2］，Shimizu等［3］发现在大鼠心肌梗死后，左室非心肌梗死区Ⅰ、Ⅲ型胶原MMP-9的mRNA较对照组明显升高。Wei等［4］研究发现大鼠心肌梗死后左室胶原持续升高至第10周，MMP-9又称明胶酶B，有着重要的生物学作用，与冠状动脉和血管重建的关系最为密切［2］，所以选择MMP-9作为研究对象。MMP-9的作用对象是ECM，ECM是血管和心肌间质的主要成分，在糖尿病冠心病及糖尿病肾病纤维化发病机制中有重要作用［3］。MMP可以导致ECM合成和降解的平衡被打破。Timps是组织中MMP的天然特异抑制物，MMP和TIMPs之间的动态平衡是保持ECM稳态的重要条件［4］，目前发现的TIMPs有4种，Timp-1、Timp-2、Timp-3 及 Timp-4。在心脏中研究较多的是Timp-1，它既可以和活化的MMP以1∶1非共价键结合，又可以与MMP酶原结合并阻止其活化，其中Timp-1随MMP-9表达增高而表达，通过抑制酶原而抑制MMP-9。当两者比例失衡时就会引起正常胶原结构遭到破坏，使缺乏交连结构的不正常胶原纤维增生沉积，引起胶原重构。本实验观察发现糖尿病心肌梗死后B、C 2组出现心肌细胞大量坏死，变性，心肌间质中大量胶原纤维渗出，心室肌出现重塑，心室顺应性明显下降。实验表明，MMP-9在心肌梗死早期即开始激活，且在心肌梗死后心室重构期间MMP-9活性和表达均显著增高，从而降解ECM，解离整联蛋白，产生修复性的纤维化［5，6］。临床研究表明，在AMI最初数天，较高的MMP-9与心肌梗死后的左室容积增加有关［7］。Kelly等［8］研究发现，AMI早期较高水平MMP-9表达可引起在心肌梗死后在数周和数月可能出现较广泛的左室重构。采用MMP-9基因缺失小鼠的研究亦发现，MMP-9基因缺失小鼠左室扩张及胶原聚积较对照组均明显减少，这些变化发现与基因缺失小鼠巨噬细胞浸润减少有关。以上研究表明，AMI后MMP-9表达及活性提高，直接降解ECM，引起ECM退化，进而导致心肌细胞排列紊乱，从而引起心室的重构，最终导致心力衰竭。

本实验结果表明心肌梗死后MMP-9活性增加，胶原纤维含量增加，是心肌梗死后心室重构的重要原因，而在EPO干预组在Masson染色下可见纤维增生显著减轻（P<0.05），在免疫组化染色中MMP-9表达显著变少（P<0.05），而Timp-1表达变化不显著（P>0.05），考虑EPO改善心肌纤维化、减轻心肌重塑作用是通过抑制MMP-9的表达及活化引起的，而不是通过增加其抑制蛋白Timp-1的产生起作用。通过分子生物学研究发现MMP-9 C-末端有血红素结合蛋白样区和铰链区，因此推测EPO可能是通过自身结构抑制MMP-9活化而起作用，减轻间质的纤维化。EPO对糖尿病兔AMI后有显著心脏保护作用，心肌间质重塑明显减轻，该作用可能与EPO抑制MMP-9的产生有关，如何引起MMP-9减轻的机制有待进一步临床和试验研究。

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