脑血管病患者高同型半胱氨酸血症发生机制的初步研究

郑伟，杨智，安殿梅，3，孟冬娅，胡晓芳

（1.沈阳军区总医院检验科，沈阳 110840；2.沈阳市胸科医院检验科，沈阳 110044；3.辽宁医学院研究生院，辽宁 锦州 121001）

高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血症是脑血管病患者重要的病理特征［1］，也是增加脑血管病发生的独立危险因素之一。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是 Hcy再甲基化途径的关键酶，其第4号外显子C677T位发生错义突变，碱基胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）置换，使酶的耐热性和活性显著降低是引起Hcy水平升高主要的遗传机制之一。而叶酸和维生素B12是Hcy代谢途径中必需的辅助因子，二者直接影响着Hcy的代谢水平［1］。本研究以脑血管病患者为研究对象，通过测定血清Hcy水平，检测分析MTHFRC677T基因多态性并检测血清叶酸和维生素B12水平，进一步探讨脑血管病患者高Hcy血症的发生机制，旨在为脑血管病的诊断和治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：选择2010年3月至2011年3月沈阳军区总医院神经内科、神经外科及急诊科病区脑血管病患者（脑血管病组）177例，其中男99例，女78例，平均年龄（61.22±11.14）岁。其中脑梗死（cerebral infarction，CI）103 例 ， 脑 出 血（cerebral hemorrhage，CH）74例。入组标准：患者均有颅脑CT和（或）MRI的影像证据，诊断符合1995年全国第4届脑血管病学术会议修订的诊断标准［2］。排除肝、肾疾病、糖尿病、恶性肿瘤、甲状腺功能异常、妊娠及服用抗惊厥药物者。无酗酒史，未服用免疫抑制剂、多种维生素及叶酸。对照组为我院健康体检者122例，其中男 71例，女 51例，平均年龄（60.25±10.30）岁。2组在年龄、性别方面差异无统计学意义（P>0.05）。

1.1.2 主要仪器与试剂：实时荧光PCR仪（美国ABI公司），紫外分光光度计（日本岛津公司），电泳槽及电泳仪（美国EC公司），凝胶成像系统（日本Kodak公司），日立-7600全自动生化分析仪（日本日立公司），AIA-1800全自动化学发光免疫分析仪（日本奥林巴斯光学株式会社）。全血DNA提取试剂盒（大连宝生物公司），探针（上海基康生物技术有限公司），PCR反应试剂（大连宝生物公司），DNA Marker（大连宝生物公司），Loading buffer（大连宝生物公司），琼脂糖（Promega公司），EB（Amresco公司），Hcy试剂盒（北京九强生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与指标检测：脑血管病组患者（于确诊入院的第1天清晨）以及对照组体检者在空腹状态下采集前臂无抗凝静脉血和EDTA-K2抗凝静脉血各3 mL。无抗凝静脉血1 h内离心（3 000 r/min，10 min）分离血清后，置于-70℃保存待测。EDTA-K2抗凝静脉血置于-70℃冰箱保存，待提取DNA。应用日立-7600全自动生化分析仪，采用酶法检测血清Hcy浓度。应用AIA-1800全自动化学发光免疫分析仪，采用化学发光免疫法分别检测叶酸和维生素B12浓度，所有操作严格按说明书进行。

1.2.2 全血基因组DNA提取：应用全血DNA提取试剂盒提取人全血DNA，所有操作严格按照试剂说明书进行。测定各样品OD260和OD280吸光度值，根据OD260/OD280值分析DNA样品的纯度。

1.2.3 实时PCR扩增MTHFRC677T基因片段：PCR引物和TaqMan MGB探针序列参考文献［3］，由上海基康生物有限公司合成。PCR产物片段长度为86 bp。MTHFRC677T引物及探针序列如下：PrimerFw：5′-GACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA-3′，Primer Rev：5′-GGAAGAATGTGTCAGCCTCAAA G-3′；probe C：FAM-AAATCGGCTCCCGCA-MGB，probeT：HEX-TGAAATCGACTCCCG-MGB。PCR反应体系：总体积 25 μL，DNA 模板 2 μL，PCR 反应液 10 μL，Primer 1（10 μmol/L）0.5 μL，Primer 2（10 μmol/L）0.5 μL，Probe 1（10 μmol/L）0.5 μL，Probe 2（10 μmol/L）0.5 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL，灭菌蒸馏水 10.5 μL。使用美国ABI-7300实时荧光PCR仪，反应条件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，循环 40 次，60℃时荧光信号检测。35℃冷却10 s。PCR扩增完毕后软件直接分析各基因型。取5 μL PCR产物，行3%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照。

1.3 统计学分析

基因型采用频率计数法，用Hardy-Weinberg平衡定律计算等位基因频率。组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验。计量资料用±s表示，组间比较用t检验、方差分析。相关性分析用Spearman相关检验。以上比较采用SPSS 17.0软件进行分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脑血管病组与对照组血清Hcy水平的比较（图1）

CI、CH组和对照组的血清Hcy水平比较，差异有统计学意义（F=19.58，P<0.01）。其中，CI组的血清 Hcy水平［（24.04±6.36）μmol/L］明显高于 CH 组［（20.39±5.56）μmol/L］，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2 实时荧光PCR法检测MTHFRC677T多态性

应用带有荧光标记的FAM和HEX的TaqMan MGB探针，分别检测MTHFR基因的CC型、CT型和TT型，根据荧光信号不同区分3种基因型。3种基因型及结果判断见图2。PCR产物电泳结果显示，目的基因产物的片段长度为86 bp，见图3。

2.3 脑血管病组与对照组的MTHFRC677T基因型分布比较

脑血管病组和对照组的MTHFRC677T基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，各等位基因均达到遗传平衡，具有群体代表性。脑血管病组和对照组的MTHFRC677T 3种基因型（CC、CT和TT）频率分别为16.9%、50.3%、32.8%及31.1%、40.2%、28.7%，2组基因型分布差异具有统计学意义（χ2=8.39，P<0.05）。脑血管病组T等位基因频率（57.9%）明显高于对照组（48.8%）（χ2=4.86，P<0.01）。其中，CI组与CH组的MTHFRC677T基因型分布和等位基因频率比较差异无统计学意义（P>0.05）。各组基因型分布及等位基因频率结果见表1。

2.4 MTHFRC677T基因多态性与血清Hcy水平的关系（图 4）

CI组、CH组以及对照组TT基因型血清Hcy水平明显高于CT型和CC型（P<0.01），但CT型和CC型的血清Hcy水平比较无统计学差异（P>0.05）。

表1 脑血管病组与对照组的M TH FR基因型及等位基因频率分布Tab.1 Distribution of MTHFR geno type and a lle le frequency in cerebrovascu lardisease group and controlgroup

2.5 脑血管病组与对照组的血清叶酸和维生素B12水平的比较

CI组和CH组血清叶酸、维生素B12水平均明显低于对照组（P<0.01），但二者比较差异无统计学意义（P>0.05）（图5）。相关分析结果显示，脑血管病组的血清叶酸和维生素B12水平与血清Hcy水平呈负相关（r1=-0.80，r2=-0.83）。

3 讨论

高Hcy血症是脑血管疾病发病的一个独立危险因素。研究显示，Hcy可致血管内皮细胞损伤和功能紊乱，引起脂蛋白和胆固醇在血管壁沉积，并可灭活血管舒张因子一氧化氮，从而促进动脉粥样硬化的发生和血栓形成［4］。本研究结果显示，CI患者血清Hcy水平明显高于正常对照组，提示血清Hcy水平与CI的发病密切相关。

有研究显示，Hcy还可通过促进血栓素和前列腺素形成而影响血小板聚集和凝血因子的活性。因此，血清Hcy浓度的升高对CH的发生和发展起重要作用［5］。本研究结果显示，CH患者血清Hcy水平明显升高，与对照组相比差异具有统计学意义，提示高Hcy血症参与CH的发病。值得关注的是，CI组血清Hcy水平明显高于CH组，进一步提示Hcy可能通过不同的作用机制或不同强度的病理反应分别参与CI和CH的发病。然而目前关于脑血管病患者高Hcy血症发生的机制尚未充分阐明。

MTHFR是Hcy再甲基化途径的关键酶，编码此酶基因第4号外显子C677T位点发生错义突变是引起该酶缺乏、活性降低从而引起血清Hcy水平升高的主要遗传机制［6］。研究证实，MTHFRC677T基因多态性与脑血管病的发生密切相关［7］。本研究采用TaqMan实时PCR技术检测MTHFRC677T基因多态性，研究结果显示，MTHFRC677T基因型及等位基因频率在脑血管病组与对照组存在统计学差异。其中脑血管病组TT基因型频率（32.8%）及T等位基因频率（57.9%）明显高于健康对照组（28.7%、48.8%，P<0.05），而 CI组与 CH 组相比，MTHFRC677T基因型及等位基因频率差异均无统计学意义。由此进一步证实，MTHFRC677T的T等位基因是脑血管病发病的易感基因。值得关注的是，本研究中脑血管病组T等位基因携带频率（57.9%）明显高于国、内外其他地区［8］，可能与研究人群的种族和所在地域有关［9］。本研究还发现MTHFR的TT型血清Hcy水平明显高于CT型和CC型，而CT型与CC型相比，无统计学差异。提示MTHFRC677T的T等位基因突变是引起血清Hcy水平升高的关键因素。

另有研究显示，叶酸和维生素B12均参与和影响Hcy的代谢，叶酸的激活使Hcy甲基化成为蛋氨酸。因此，叶酸和维生素B12的缺乏均可致高Hcy血症的发生［10］。本研究结果显示，脑血管病组的血清叶酸和维生素B12水平均明显低于对照组，与此相反，脑血管病组血清Hcy水平显著高于对照组，且血清叶酸、维生素B12水平与血清Hcy水平呈负相关。更为重要的是，已有研究证实，补充叶酸和维生素B12可有效降低血清Hcy水平，能有效预防和减少脑血管病的发生［11］，提示叶酸和维生素B12与Hcy可能存在负反馈的调节机制。脑血管病的发生可能正是这种调节机制失衡的结果。基于以上发现，我们有理由推测，血清Hcy水平不仅与其相关代谢酶基因突变有关，还与其代谢辅助因子密切相关。另有研究显示，MTHFRC677T突变可降低体内叶酸储备水平［12］。由此可以推测，脑血管病患者低水平叶酸血症的发生同样依赖于MTHFR基因突变。

脑血管病是一种多因素所致的复杂性疾病，其中，高Hcy血症是导致脑血管病发生的独立危险因素。而影响Hcy代谢途径的遗传和营养因素，正是导致高Hcy血症发生的关键因素。MTHFRC677T的T等位基因是脑血管病发病的易感基因，此基因突变是引起血清Hcy水平升高的主要遗传因素。与此同时，低水平的叶酸和维生素B12与高Hcy血症的发生密切相关。

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