NK4基因转染对人宫颈癌细胞CaSki生物学特性的影响

王晓黎，王冬冬，赖亚新，林蓓

（中国医科大学1.附属第一医院内分泌科，沈阳 110001；2.附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

宫颈癌是妇科三大恶性肿瘤之一，严重威胁全球女性的健康与生命［1］。随着人乳头瘤病毒感染的蔓延和播散，宫颈癌的发病年龄已出现明显的年轻化趋势，目前的治疗方案以手术和放射治疗为主，但中晚期患者治愈率很低。因此，研究宫颈癌的治疗新策略显得尤为重要。

NK4（an N-terminal hairpin domain and a four-Kringle domain of hepatocyte growth factor）是通过对重组人肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）进行消化裂解后得到的一种多肽产物，它由HGF的a链N末端的447个氨基酸和4个Kringle区域所组成，故命名为 NK4，分子量为 50 kDa［2］。NK4可以与c-Met结合，竞争性地完全抑制HGF和c-Met的相互作用，影响HGF/c-Met通路的信号转导，从而抑制HGF诱导的细胞增殖、运动和形态形成等作用，但其本身不能诱导c-Met的酪氨酸磷酸化而使其活化。NK4与血管抑制剂—血管抑素的结构具有显著的相似性，有很强的抗血管生成作用［3］。体外研究证实，NK4可抑制HGF诱导包括人胆囊癌、胆管癌、乳腺癌、前列腺癌及胰腺癌等细胞的运动和侵袭［4～7］。为了研究NK4在宫颈癌中的作用，本研究通过转染NK4基因表达质粒，研究了它对宫颈癌细胞CaSki生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

宫颈癌细胞株Caski培养在含10%新生牛血清、100 IU/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，置37℃、5%CO2孵箱中培养。

1.2 基因转染

将NK4基因表达序列插入pCMV-IRES-bsr质粒的SmaI位点，构建pCMV-NK4-IRES-bsr质粒，同时构建pCMV-LUC（荧光霉素）-IRES-bsr质粒作为对照。用标准的磷酸钙沉淀方法转染CaSki细胞。经过4周的荧光霉素筛选得到NK4稳定表达的CaSki/NK4细胞株和CaSki/LUC对照细胞株。

1.3 转染细胞NK4蛋白表达测定

选择耐药克隆株应用Western blot检测NK4蛋白表达。将CaSki/NK4细胞和对照细胞株CaSki/LUC置于直径6 cm培养皿中培养，待细胞融合度达80%时换成无血清培养基培养24 h，取上清液检测NK4蛋白表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移到醋酸纤维素膜上，加入一抗HGF-α（N-17）：sc-1357（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC.），孵育过夜，TBST冲洗3次，加入二抗antigoat IgG孵育1 h，TBST冲洗3次后，曝光显影。

1.4 抑制c-Met磷酸化测定

将CaSki、CaSki/LUC和CaSki/NK4的培养基分别转入有5×105个CaSki细胞的3.5 cm培养皿中孵育过夜后，收集细胞裂解液，用c-Met抗体按照试剂盒说明书步骤免疫沉淀后（Dynabeads protein A immunoprecipitation kit，Invitrogen 公司），用 Western blot检测c-Met及其活化后产物p-Met在不同培养基中生长的细胞内的表达。

1.5 细胞生长曲线测定

应用MTT试剂盒测定细胞生长曲线。按每孔100个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL，将培养板移入37℃、CO2孵箱中培养，每24 h在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，以时间为横轴、光吸收值为纵轴，绘制细胞生长曲线。

1.6 细胞划痕实验

将 2×105个 CaSki、CaSki/LUC 和 CaSki/NK4 细胞分别在3.5 cm培养皿中培养至细胞融合度达90%，用200 μL枪头分别在3个培养皿中央垂直做1条相同宽度的划痕，换无血清培养基培养24 h后，计数划痕中的细胞个数。

1.7 统计学分析

实验结果以±s表示，组间比较采用组间Student′st检验。使用SPSS 17.0统计软件完成统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NK4蛋白的表达

应用 Western blot方法检测 CaSki、CaSki/LUC和CaSki/NK4细胞培养基上清液中NK4的表达情况。结果显示，CaSki/NK4表达阳性，CaSki和CaSki/LUC中NK4无表达（图1）。

2.2 NK4拮抗HGF抑制c-Met磷酸化

Western blot检测结果显示，CaSki、CaSki/LUC和CaSki/NK4 3种培养基上清培养的CaSki细胞裂解液中，c-Met均为阳性，CaSki/NK4培养基培养的CaSki细胞裂解液中c-Met及其活化后产物p-Met阴性，其余2种细胞裂解液中则为阳性（图2）。

2.3 细胞体外生长曲线测定

CaSki/NK4细胞和对照（CaSki，CaSki/LUC）细胞在体外生长速度上无明显差异（图3）。

2.4 细胞划痕实验

MTT结果显示，CaSki/NK4划痕区域的细胞数［（2.8±2.0）/mm2］明显少于CaSki［（33.2±16.2）/mm2］和 CaSki/LUC［（34.3±17.6）/mm2］（图 4）。

3 讨论

HGF 又称分散因子（scatter factor，SF），是由间质细胞产生的细胞因子。最初因其对肝细胞具有很强的丝裂原作用而命名［8］。HGF与c-Met结合后，c-Met的激酶结构域自动磷酸化，可导致多种底物蛋白的酪氨酸磷酸化，逐级将信号放大，最终转入细胞核，引起一系列生物效应［9］。大量研究表明，HGF/c-Met系统对于肿瘤细胞的增殖、存活、侵袭、转移及血管形成具有促进作用。目前针对c-Met信号通路的肿瘤治疗主要包括4类：受体/配体拮抗剂，针对酪氨酸激酶催化活性的小分子抑制剂，阻断受体与其下游效应因子的相互作用及降低细胞表面的c-Met受体数量。HGF拮抗剂中最具代表性的是NK4，具有拮抗HGF和抑制血管生成的双重作用［10］。尽管NK4与c-Met受体的亲和力仅为HGF的1/8，但NK4与c-Met结合，可以竞争性地完全抑制HGF和c-Met的相互作用。NK4第1个Kringle区域可抑制细胞增殖，从而引起细胞凋亡；N端竞争性抑制血管生成因子与血管内皮细胞的结合，阻碍血管生成。NK4影响HGF/c-Met系统的信号转导，但其本身不能诱导c-Met的酪氨酸磷酸化，从而抑制HGF所诱导细胞的增殖、运动和形态生成作用，从而抑制肿瘤的生长和扩散［11］。

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第2位，仅次于乳腺癌。据统计，全世界每年约有50万左右的宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的5%，其中80%的病例发生在发展中国家。我国约为10万，约占全世界的1/4，其发病呈现年轻化趋势，且发病率逐年上升。手术和放疗作为宫颈癌最常用的主要治疗手段，疗效是肯定的。通常情况下，手术用于早期患者，放疗多用于中晚期患者。但无论手术技巧和方法的改进还是放疗设备和技术的进步都没有明显提高宫颈癌的5年生存率。尤其对于晚期患者来说，局部复发仍旧是一个未解决的难题，因此，寻求手术、放疗和化疗之外的基因治疗和免疫治疗方法成为目前提高宫颈癌患者预后的主要研究方向。近期有研究显示，宫颈癌细胞中c-Met的表达可以作为宫颈癌总生存率的独立预测指标，对于宫颈癌组织中有c-Met的过度表达的宫颈癌患者需要加大治疗强度［12］。因此，探求针对c-Met表达的基因治疗方法可以为宫颈癌治疗提供一个新方法。从上世纪80年代以来，基因治疗就被作为一种可能的通过修饰遗传过程来治疗某一种特定疾病的方法加以研究，1990年进行了首例人体基因治疗并获得基因治疗的成功。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。本研究通过在宫颈癌细胞CaSki中转染NK4基因表达质粒，研究NK4蛋白表达对宫颈癌细胞生物学行为的影响，发现成功构建NK4表达CaSki细胞后，NK4蛋白能够在培养基中大量分泌，且NK4具有抑制c-Met磷酸化的作用。体外实验结果显示，在CaSki中转染NK4和对照质粒对肿瘤细胞体外生长的速度无影响，但能抑制肿瘤细胞体外活动的能力。从而验证了NK4可通过HGF拮抗剂作用抑制人宫颈癌细胞c-Met受体磷酸化，并能抑制宫颈癌细胞体外活动能力。此结果与文献报道相一致［13］，为应用NK4进行宫颈癌基因治疗提供了研究基础。

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