钩藤碱对阿霉素诱导的大鼠肾损伤的作用及其机制*

龙吉美，黄德彬，李魁武，罗 琼

(1湖北省建始县人民医院，湖北 建始 445300;2湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000)

钩藤碱(rhynchophylline，RHL)系茜草科植物钩藤[Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jackson]的主要成分。钩藤水提取物具有息风定惊、清热平肝等功效[1]。现代药理学研究证实，RHL具有保护脑缺血再灌注所致的脑损伤作用，还具有显著的钙拮抗、抑制心肌重构、降低血压、抗心律失常等作用[2]。临床用于治疗高血压、支气管哮喘、癫痫等疾病[3]。有研究报道，钩藤碱和异钩藤碱能显著抑制血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)所导致的血管重塑[3]，其机制与下调NF－κB蛋白表达及抑制c－myc、c－fos基因mRNA转录有关[2]。我们研究发现钩藤碱具有改善阿霉素肾病大鼠肾功能的作用，其机制与增强超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，減少丙二醛(malondialdehyde，MDA)生成，调控肾组织血管紧张素受体1、2(angiotensin receptors 1，2，AT1，2－ R)、血管紧张素转换酶(angiotensin － converting enzyme，ACE)和 血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)mRNA表达等相关。但RHL对阿霉素肾病大鼠肾损伤的作用尚不清楚，本研究观察RHL对阿霉素致大鼠肾功能损伤的作用并探讨其机制。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 SPF级成年雌性SD大鼠52只，体重 (180±20)g(重庆医科大学实验动物中心，4110817)。分笼饲养(每笼3～4只)，温度维持在(25±3)℃，相对湿度(55±15)%，按光照与黑暗每天12 h轮替。饲料与饮水均经灭菌处理。

1.2 器材 大鼠代谢笼(M－5，1410 mm×400 mm×1550 mm，上海中胜科教设备有限公司);全自动生化分析仪(美国思博名科学器材公司);石蜡包埋机(EG1150－H);切片机(RM2245);全自动组织脱水机和显微镜(DM2000);全自动显微镜数码摄像系统(Olympus);电子分析天平(Sartorius);3K30型低温高速离心机(Sigma);超纯水装置(Millipore);Du－7500紫外分光光度计(Beckman);TP600型PCR基因扩增仪(TaKaRa);电泳仪及电泳槽(江苏仪器厂);LG2020D型凝胶成像分析系统(北京君意东方电泳设备有限公司);F200酶标仪(帝肯);微量加样器(Gilson)。

1.3 主要试剂 水合氯醛(上海金贸泰化工有限公司);钩藤碱(RHL，Sigma);阿霉素(adriamycin，ADR，Sigma);SOD 和MDA检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，NBT法和TBA法);伊红、苏木素、多聚赖氨酸、S－P试剂盒及DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术有限公司);PCR引物和DL2000 DNA marker(大连宝生物工程公司);PV6001二步法检测试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉金桥);Trizol Reagent和引物核苷酸片段(Invitrogen);M－MuLV反转录酶(Promega);琼脂糖(Promega);PCR Mix试剂盒(北京天根生化科技有限公司)。

2 方法

2.1 动物分组与处理 随机将大鼠分成4组，即生理盐水组(NSG，n=10)、模型组(MG，n=14)、钩藤碱低剂量治疗组(RHL－LG，n=14)和高剂量治疗组(RHL－HG，n=14)。MG、RHL－LG和RHL－HG经尾静脉注射阿霉素(5 mg·kg－1)制造肾病模型，NSG注射等容量生理盐水(NS)。2周后检测尿蛋白含量为(+++)者纳入肾病模型实验(比例为65%)，MG、RHL－LG和 RHL－HG分别为8只、10只和9只。各组大鼠适应性喂养1周后，RHL－LG和RHL－HG分别给予腹腔注射 RHL 5mg·kg－1和 15 mg·kg－1[4]，NSG、MG分别给予腹腔注射等容量NS，共治疗8周。

2.2 标本收集

2.2.1 血液标本采集 自眼眶静脉丛采血。先按压大鼠颈部两侧，让眼眶静脉丛充分充血，以毛细玻璃管自眼内角呈45°角刺入，采集血液约 1～2 mL，室温静置 15 min，4 ℃、3000 r/min离心15 min，吸取血清，以生化指标检测备用。

2.2.2 尿液的收集 用代谢笼采集尿液标本。分别于0周、2周、4周、6周、8周的最后1 d收集24 h尿液标本，测量24 h尿量，吸取尿液，25℃、1000 r/min离心10 min后，取上清液放入－20℃冰箱保存备用。

2.2.3 肾组织标本采集 动物处死前，以水合氯醛(10%，3mg/kg)腹腔麻醉，迅速摘下右肾置入液氮保存备用。左肾以4%多聚甲醛固定，HE染色、免疫组化染色备用。

2.3 标本检测

2.3.1 生化指标检测 以全自动生化分析仪检测血清和尿液中总蛋白、白蛋白、血清肌酐(serum creatinine，SCr)及血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)等指标。24 h尿蛋白定量计算方法[5]:24 h尿蛋白定量(mg/d)=尿蛋白浓度(mg/L)×24 h尿量(L)。

2.3.2 MDA含量与SOD活性分析 严格按照厂家说明书用试剂盒检测MDA含量和SOD活性，简要地说，就是用匀浆机将实验动物的肝组织匀浆，取上清液样品用于MDA含量和SOD活性分析，在586 nm波长范围内检测MDA含量 和SOD活性。

2.3.3 病理学检测(HE染色) 以10%甲醛固定24 h，经梯度乙醇(70%、80%、95%、100%)脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明处理，常规浸蜡包埋，脱蜡，苏木素染核，分化，反蓝，脱水，中性树胶封固。

2.3.4 RT － PCR 检测 AT1，2－ R、ACE 及 AGT mRNA 表达按文献[6]用RT－PCR法半定量分析各自mRNA水平(用Trizol试剂提取肾组织总RNA)。取100 mg液氮冻存肾组织研磨，加入Trizol 1 mL，用匀浆器匀浆，25℃孵育10 min。4℃、12000×g离心5 min，弃沉淀。吸取上清液加入新离心管，加入氯仿200 μL，混匀，于 25℃静置 5 min，再离心 15 min(12000×g、4℃)。吸取上清液，加入另一离心管，加入0.5 mL异丙醇，25℃静置10 min。继续离心10 min(4℃、12000×g)，去除上清液，以乙醇洗涤RNA沉淀(75%，1 mL)，混均匀。离心5 min(4℃、80000×g)，弃上清。再漂洗沉淀，25℃晾干，沉淀 RNA 10 min。用 30～50 μL RNase－free ddH2O溶解沉淀，55℃水浴助溶10 min，漩涡混匀30 s，离心(4℃、120000×g)，得到上清RNA样品。

RT反应:取5 μL加入DEPC处理的45 μL无菌水，用紫外分光光度计测量A值检测RNA(A260/A280在1.8～2.0为纯度合格)。另取5 μL，以琼脂糖甲醛变性胶电泳对RNA进行鉴定，余下部分于－85℃冰箱保存备用。按AMV逆转录酶说明书进行第一链cDNA合成。取AMV逆转录酶1 μL，5×RT 反应缓冲液4 μL，dNTP 混合物4 μL(每种2.5 mmol/L)，Oligo dT15Primers 2 μL(50 μmol/L)，总 RNA 2 μg，最后加入适量RNase－free ddH2O至总体积达20 μL。将混合物置10 min(25℃)，置入水浴孵育1 h(42℃)得cDNA，吸取cDNA 2 μL进行PCR扩增。

PCR 反应:2 μL cDNA，12.5 μL 2 × Taq Master，10 pmol相应引物，加入适量ddH2O至25 μL。吸取10 μL扩增物，用琼脂糖凝胶(2%)行DNA电泳，Tanon－1600 Figure Gel凝胶成像系统拍照，以软件GIS1D Gel Image System分析条带吸光度(A值)，结果以目的基因和β－actin A值比值表示。其引物序列如下:AT1－R上游引物5'－GCACAATCGCCATAATTATCC －3'，下游引物 5'－ CACCTATGTAAGATCGCTTC －3'，扩增片段445 bp，退火温度53℃;AT2－R上游引物5'－GTGTCCAGCATTTACATCTTCA －3'，下游引物 5'－CACCAAACAAGGGGAACTAC－3'，扩增片段275 bp，退火温度，55℃;ACE 上游引物5'－GCAGAACTTCACTGACCAAAAG －3'，下游引物5'－TCAAAGGAGGGGGACTCATA－3'，扩增片段 383 bp，退火温度55℃;AGT上游引物5'－TTGTTGAGAGCTTGGGTCCCTTCA－3'，下游引物 5'－CAGACACTGAGGTGCTGTTGTCCA－3'，扩增片段265 bp，退火温度60℃;β－actin上游引物5'－GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT－3'，下游引物5'－AAGAATGGGTGTTGCTGTTGAAGTC －3'，扩增片段617 bp，退火温度55℃。

3 统计学处理

结 果

1 RHL对大鼠24 h尿蛋白的影响

MG、RHL－LG和RHL－HG经尾静脉注射阿霉素2周后出现蛋白尿，显著高于NSG(P＜0.05)，表明急性肾功能衰竭模型制造成功。24 h尿蛋白含量从2～8周呈现持续上升趋势。RHL－LG显著低于MG，而高于RHL－HG(P＜0.05)，呈现明显的剂量依赖趋势，见图1。

Figure1.Effect of RHL on 24 h urine protein in rats.*P ＜0.05vs NSG;△P＜0.05 vs MG;▲P＜0.05 vs RHL－LG.图1 RHL对大鼠24 h尿蛋白的影响

2 RHL对大鼠血清中BUN和SCr含量的影响

MG、RHL－LG和RHL－HG血清中BUN和SCr显著高于NSG(P＜0.05)，表明急性肾功能衰竭模型制造成功。其中，RHL－LG血清中的BUN和SCr显著低于MG，而高于RHL－HG(P＜0.05)，呈现明显的剂量依赖趋势，见表1。

表1 RHL对大鼠血清中BUN和SCr含量的影响Table1.Effects of RHL on BUN and SCr in rats()

表1 RHL对大鼠血清中BUN和SCr含量的影响Table1.Effects of RHL on BUN and SCr in rats()

*P＜0.05 vs NSG;△P＜0.05 vs MG;▲P＜0.05 vs RHLLG.

Group n BUN(mmol/L) SCr(μmol/L)NSG 10 7.93 ±1.67 31.58 ±2.06 MG 8 23.43 ±2.54* 56.84 ±3.25*RHL － LG 10 16.95 ±1.83＊△ 44.15 ±2.76＊△RHL － HG 9 10.17 ±1.37＊△▲ 37.92 ±3.71＊△▲

3 RHL对大鼠肾组织形态学的影响

与NSG相比，MG、RHL－LG和RHL－HG大鼠肾小球毛细血管显著充血，系膜区明显增厚，系膜基质显著增多，足突细胞明显肥大。RHL－LG的炎症、系膜区增厚和系膜基质增多明显轻于MG，肾小球充血及肾小球管型明显少于MG。而RHL－HG的病理改变又显著轻于RHL－LG，见图2。

Figure2.Effects of RHL on the morphology of rat renal tissues(HE staining，×400).图2 RHL对大鼠肾组织形态学的影响

4 RHL对大鼠肾组织中SOD活性及MDA含量的影响

MG、RHL－LG和RHL－HG大鼠肾组织中SOD活性显著低于NSG(P＜0.05);MG显著低于RHL－LG，而RHLLG又明显低于 RHL－HG(P＜0.05)。MG、RHL－LG和RHL－HG大鼠肾组织中 MDA含量显著高于 NSG(P＜0.05);MG显著高于 RHL－LG，而RHL－LG又明显高于RHL－HG(P＜0.05)，见表2。

表2 RHL对大鼠肾组织中SOD活性与MDA含量的影响Table2.Effects of RHL on SOD activity and MDA content in rat renal tissues()

表2 RHL对大鼠肾组织中SOD活性与MDA含量的影响Table2.Effects of RHL on SOD activity and MDA content in rat renal tissues()

*P＜0.05 vs NSG;△P＜0.05 vs MG;▲P ＜0.05 vs RHL－LG.

Group n SOD[μmol/(g protein)]MDA[μmol/(g protein )]NSG 10 533.62±27.71 1.37±0.25 MG 8 297.54±21.57* 4.08±0.41*RHL－LG 10 379.46±29.61＊△ 3.42±0.28＊ △RHL－HG 9 457.18±30.06＊△▲ 2.28±0.21＊△▲

5 RHL对大鼠肾组织中AT1，2－R、ACE和AGT mRNA表达的影响

MG大鼠肾组织中AT1－R、ACE和 AGT mRNA表达显著高于NSG和RHL－LG，而RHL－LG又显著高于RHLHG(P＜0.05)，MG和RHL－LG大鼠肾组织中AT2－R mRNA表达显著低于NSG和RHL－HG(P＜0.05)，MG显著低于RHL－HG，RHL－LG与NSG间无显著差异(P＞0.05)，见图 3、表 3。

Figure3.Effects of RHL on the mRNA expression of AT1，2 － R，ACE and AGT in rat renal tissue.M:DNA marker;a:RHL － HG;b:RHL－LG;c:MG;d:NSG.图3 RHL对大鼠肾组织中AT1，2－R、ACE和AGT mRNA表达的影响

表3 RHL对大鼠肾组织中AT1，2－R、ACE和 AGT mRNA表达的影响Table3.Effects of RHL on the mRNA expression of AT1，2－R，ACE and AGT in rat renal tissues()

表3 RHL对大鼠肾组织中AT1，2－R、ACE和 AGT mRNA表达的影响Table3.Effects of RHL on the mRNA expression of AT1，2－R，ACE and AGT in rat renal tissues()

*P＜0.05 vs NSG;△P＜0.05 vs MG;▲P＜0.05 vs RHL－LG.

－actin NSG 10 1.00 ±0.14 1.00 ±0.17 1.00 ±0.13 1.00 ±0.Group n AT1－R/β －actin AT2－R/β －actin ACE/β －actin AGT/β 11 MG 8 1.64 ±0.18* 0.43 ±0.15* 1.94 ±0.16* 1.52 ±0.12*RHL －LG 10 1.13 ±0.09△ 0.68 ±0.07＊△ 1.61 ±0.15＊△ 1.17 ±0.08△RHL －HG 9 0.71 ±0.13＊△▲ 0.98 ±0.18△▲ 1.33 ±0.08＊△▲ 0.67 ±0.14＊△▲

讨 论

肾脏疾病发病率呈逐年上升趋势，现已超过7%。据最新资料报道[4]，全球已超过5亿肾脏疾病患者，特别是慢性肾脏疾病已成为继肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病之后威胁人类健康的重大疾病，目前还没有充分有效的手段阻止其肾功能进行性下降[5]。肾功能衰竭主要病理变化表现为肾小管间质损伤，出现肾小管间质炎细胞浸润、细胞表型转化、上皮细胞变性、坏死、萎缩和间质纤维化等。研究表明，肾小管间质病变是反映肾功能下降程度以及判断其转归的关键指标[6]。以前人们一直认为，蛋白尿、血尿素氮和肌酐升高是肾小球疾病的主要临床表现，直接反映肾小球的损伤程度。但随着肾脏疾病研究的发展，人们逐渐认识到这些症状不仅是肾小球损伤的生物学标志，而且还是参与肾脏疾病发展的一个独立致病因素[5]，可直接加速肾小球硬化和肾小管间质损伤。

RHL具有扩张血管和抗高血压的作用，有很好的临床应用价值。本研究显示，经尾静脉注射阿霉素的各组大鼠2周后开始出现蛋白尿，并有BUN和SCr显著升高，其浓度从2～8周呈现持续上升趋势。RHL－LG显著低于MG组，而高于RHL－HG，呈现明显的剂量依赖趋势。肾组织形态学观察结果显示，与NSG相比，MG组、RHL－LG和RHL－HG大鼠肾小球毛细血管显著充血，系膜区明显增厚，系膜基质显著增多，足突细胞明显肥大。其中RHL－LG的炎症、系膜区增厚、系膜基质增多以及肾小球充血显著轻于MG组，肾小球管型明显少于MG组。而RHL－HG又显著轻于RHL－LG。这些证据提示，RHL能减轻阿霉素所致的大鼠肾功能损伤，其作用机制可能与以下因素有关:(1)RHL增强肾组织中SOD活性与降低MDA含量，维持肾脏组织代谢与功能，阻止肾小管细胞凋亡:阿霉素损伤肾小管后，肾脏组织产生氧自由基，直接破坏肾小管膜的多不饱和脂肪酸而诱发脂质过氧化反应[7]，其反应结果是将活性氧转为非自由基性脂质产物，由链式反应放大活性氧效应，产生MDA、酮基等多种脂质过氧化物[8]。MDA能引起核酸、蛋白质等大分子物质交联聚合，产生细胞毒性效应，并伴随细胞代谢紊乱和功能障碍，最终导致肾小球和肾小管细胞凋亡[2，9]。因此，MDA含量能直接反映肾组织脂质过氧化的程度和肾小管细胞损伤程度。SOD是机体内清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，SOD可清除肾脏组织中氧自由基，阻止氧自由基诱发的脂质过氧化反应，防止肾小管细胞损伤。因此，SOD活性可直接反映肾组织清除氧自由基的能力。本研究表明，MG组MDA含量显著高于RHL－LG，而RHL－LG又显著高于 RHL－HG;MG组SOD活性显著低于RHL－LG，而RHL－LG又显著低于RHLHG。因此，RHL减轻阿霉素致肾功能损伤的作用与增强SOD活性和抑制MDA的生成，从而改善肾组织的代谢功能，减少肾小管细胞凋亡有关。(2)RHL调控肾组织中AT1，2－R、ACE和 AGT mRNA表达，增加肾组织血流量，减轻肾小管纤维化:肾素－血管紧张素系统是重要的血压调节系统，其主要家族成员为:肾素、AGT、ACE、AngⅠ、AngⅡ、AT1，2－ R及醛固酮(aldosterone，ALD)等。肾素使AGT转化为AngⅠ，AngⅠ在ACE作用下转变为AngⅡ，AngⅡ与AT1－R结合促使血管收缩，促进ALD分泌，增强钠、水潴留，持续升高血压。另一方面，AngⅡ作用于AT2－R，激活NO合酶活性、促进NO的合成[10－11]。而NO是一种不稳定的自由基，是一种新型生物信使分子，具有松弛平滑肌、抑制血小板黏附和炎症细胞浸润，调节局部组织血流量，降低血压，抑制血管内皮细胞增殖与迁移的作用[12－13]。

本实验结果显示，MG组AT1－R、ACE和AGT mRNA表达显著高于RHL－LG，而RHL－LG又显著高于RHL－HG;MG组和RHL－LG肾组织中AT2－R mRNA表达显著低于RHL－HG治疗组;其中，MG组显著低于RHL－LG治疗组，表明RHL抑制AT1－R、ACE和AGT mRNA表达而上调AT2－R mRNA表达。这与有关报道的RHL能抑制ACE活性、减少AngⅡ的生成[14]、增强肾性高血压大鼠NO/eNOS系统的报道一致[15]。因此，RHL改善阿霉素大鼠肾功能的机制可能与其抑制肾组织中AT1－R、ACE和AGT mRNA表达，上调AT2－R mRNA表达，增加肾组织血流量有关。

[1]李艳菊，孙安盛，余丽梅，等.钩藤碱对AngⅡ诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用[J].中国药学杂志，2008，4(21):1621 －1624.

[2]李运伦.钩藤碱和异钩藤碱抑制血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖及相关机制[J].中国药理学通报，2008，24(1):53 －58.

[3]刘 卫，张兆芹，赵晓民，等.钩藤总碱预处理对海马神经元急性缺氧的保护作用[J].中国中药杂志，2006，31(9):763－765.

[4]Dhingra R，Pencina MJ，Schrader P，et al.Relations of matrix remodeling biomarkers to blood pressure progression and incidence of hypertension in the community[J].Circulation，2009，119(8):1101 －1107.

[5]Misra S，Fu AA，Puggioni A，et al.Increased shear stress with upregulation of VEGF－A and its receptors and MMP－2，MMP－9，and TIMP－1 in venous stenosis of hemodialysis grafts[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294(5):H2219－H2230.

[6]Shenoy V，Ferreira AJ，Qi Y，et al.The angiotensin － converting enzyme 2/angiogenesis－(1－7)/Mas axis confers cardiopulmonary protection against lung fibrosis and pulmonary hypertension[J].Am J Respir Crit Care Med，2010，182(8):1065 －1072.

[7]何 娜，孙安盛，吴 芹，等.钩藤碱对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大的抑制作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2010，24(4):255 －258.

[8]Ainscough JF，Drinkhill MJ，Sedo A，et al.Angiotensin II type－1 receptor activation in the adult heartcauses blood pressure－independent hypertrophy and cardiac dysfunction[J].Cardiovasc Res，2009，81(3):592 －600.

[9]Kunz R，Friedrich C，Wolbers M，et al.Meta － analysis:effect of monotherapy and combination therapy with inhibitors of therenin angiotensin system on proteinuria in renal disease[J].Ann Intern Med，2008，148(1):30 －48.

[10]Mizuiri S，Hemmi H，Arita M，et al.Expression of ACE and ACE2 in individuals with diabetic kidney disease and healthy controls[J].Am J Kidney Dis，2008，51(4):613－623.

[11]Ferreira AJ，Shenoy V，Yamazato Y，et al.Evidence for angiotensin－converting enzyme 2 as a therapeutic target for the prevention of pulmonary hypertension[J].Am J Respir Crit Care Med，2009，179(11):1048 －1054.

[12]刘英超，王银环，耿 菲.ACE/ACE2在 AGT－REN双转基因高血压小鼠肾组织的表达变化及意义[J].中国病理生理杂志，2012，28(1):35 －40.

[13]黄燮南，石京山，谢笑龙，等.钩藤碱和异钩藤碱对45Ca转运的影响[J].中国药理学通报，1993，9(6):428－430.

[14]曹雯娟，王华东，陆大祥，等.钩藤碱降低内毒素血症小鼠死亡率的机制研究[J].中国病理生理杂志，2008，24(6):1148－1154.

[15]张丽心，孙 涛，曹永孝.钩藤碱的降压及舒张血管作用[J].中药药理与临床，2010，26(5):39 －42.