IGFBP7对人乳腺癌MCF－7细胞增殖的影响及其机制*

袁 磊，左曙光，范文娟，宋国华

(漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462002)

胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin－like growth factor binding proteins，IGFBPs)是一个能够与胰岛素样生长因子(insulin－like growth factor，IGF)结合的蛋白质家族。根据与IGF亲和力的高低可将IGFBP超家族分成两类:高亲和力IGFBPs(IGFBP1～6)和低亲和力 IGFBPs(IGFBP7 ～ 10)[1]。与高亲和力IGFBPs相比，低亲和力IGFBPs与IGFs的亲和力低5～25倍，这提示低亲和力IGFBPs可能发挥一些与IGFBP家族其它成员不同的生物学作用。IGFBP7 是第一个被证实的低亲和力 IGFBPs[2－3]。IGFBP7在正常人体多种组织、器官中广泛表达，如心脏、脾脏、小肠、大肠、卵巢、乳腺等，然而在多种肿瘤组织中却表达下调甚至缺失，如黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌等。IGFBP7在正常乳腺导管和小叶上皮细胞均有表达[4]，在衰老的乳腺上皮细胞中过表达(可达正常水平的10倍)[5]，但在乳腺癌组织中表达下降[6]，并且癌组织的侵袭力和恶性程度越高其表达越低[7]。因此IGFBP7可作为特异性标志物用于乳腺肿瘤的病理学和血清学诊断。大量研究表明，IGFBP7可抑制多种肿瘤组织的生长，促进肿瘤细胞的衰老和凋亡。本研究通过构建稳定表达IGFBP7的人乳腺癌MCF－7细胞，探究IGFBP7对人乳腺癌MCF－7细胞增殖的影响及其分子生物学机制。

材料和方法

1 动物

MCF－7细胞购自中国科学院细胞库，大肠杆菌菌株DH5α由学校分子医学实验中心提供。

2 主要试剂

胎牛血清和RPMI－1640培养基购自Gibco;质粒pCMV6－IGFBP7购自OriGene;质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒购自北京天根公司;限制性核酸内切酶Sgf I和Not I购自大连宝生物公司;Effectene转染试剂盒购自Qiagen;兔抗人IGFBP7、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal－regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)、p － ERK1/2、细胞周期素(cyclin)D1、cyclin E、细胞周期素依赖性激酶(cyclindependent kinase，CDK)2、CDK4、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p53、Rb、p－Rb抗体和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔 IgG购自 Sigma;ECL显色试剂盒购自上海汉恒公司。

3 主要方法

3.1 质粒pCMV6－IGFBP7的酶切鉴定及空质粒制备 以DH5α大肠杆菌制备感受态细胞，转化质粒pCMV6－IGFBP7，37℃过夜，挑取单菌落，置于含有氨苄青霉素(ampicillin，AMP)的 LB培养基中，37℃、200 r/min过夜。采用质粒提取试剂盒提取质粒pCMV6－IGFBP7。将质粒pCMV6－IGFBP7于37℃由限制性核酸内切酶Sgf I和Not I酶切过夜，经1%琼脂糖凝胶电泳后，采用DNA纯化试剂盒回收琼脂糖凝胶中pCMV6质粒片段，先用T4 DNA聚合酶将质粒片段末端平滑化，再经T4连接酶连接后即为空质粒pCMV6。

3.2 MCF－7细胞培养 用含10%胎牛血清的RPMI－1640培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养MCF－7细胞，每隔48 h更换1次细胞培养液。待MCF－7细胞覆盖瓶底达80%以上时，用0.125%胰蛋白酶消化传代。实验前更换为不含胎牛血清的RPMI－1640培养基继续培养24 h。

3.3 构建稳定表达IGFBP7的MCF－7细胞系 采用Effectene转染试剂盒将质粒pCMV6－IGFBP7和空质粒pCMV6分别转染入MCF－7细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中培养6 h后用PBS洗去转染试剂，加入新鲜的培养基和G418(终浓度为0.5 g/L)，继续培养2周，即可获得稳定转染子。

3.4 实验分组 实验分成4组，每组5个孔。Control组:正常培养的MCF－7细胞;empty组:稳定转染空质粒pCMV6的MCF－7细胞;IGFBP7组:稳定转染质粒 pCMV6－IGFBP7的 MCF－7细胞;PD98059组:经 PD98059(终浓度为10 μmol/L)作用72 h的MCF－7细胞。

3.5 软琼脂克隆形成实验 将1.2%低熔点琼脂糖与细胞培养基以1∶1的体积比混合制备0.6%的底层琼脂，注入6孔板中，每个孔1.4 mL，温室凝固备用。将细胞经胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，调整细胞浓度至1×107/L。将0.6%低熔点琼脂糖与细胞培养基以1∶1的体积比混合，制备0.3%的上层琼脂，向每孔加1 mL上层琼脂和50 μL单细胞悬液(500 cells/well)，混匀，室温凝固。置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养3周，计数直径大于100 μm的克隆，计算克隆形成率(colony－forming efficiency，CFE)，CFE(%)=克隆数/接种数 ×100%。

3.6 细胞周期检测 制备各实验组细胞悬液，用冷PBS洗涤细胞2次，加入1 mL 70%冰乙醇于4℃固定24 h，离心去除乙醇，再用冷PBS洗涤细胞2次，加入1 mL PI溶液(50 mg/L)，4℃避光染色30 min，送流式细胞仪检测。

3.7 Western blotting 裂解各组细胞提取总蛋白。用Bradford法测定蛋白浓度。将总蛋白经SDSPAGE分离后转移至PVDF膜。将PVDF膜移入含有封闭液(5%脱脂奶粉)的平皿中，室温下封闭1 h后，分别加入Ⅰ抗(兔抗人 IGFBP7、ERK1/2、p－ERK1/2、 cyclin D1、 CDK4、 cyclin E、 CDK2、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p53、Rb 和 p － Rb 抗体)，4 ℃ 过夜。加入Ⅱ抗(HRP标记的山羊抗兔IgG)室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL显色液显色。运用ImageJ软件测定条带灰度值，以p－Rb、p－ERK1/2条带分别与Rb、ERK1/2条带的灰度值之比衡量其的磷酸化水平，以 IGFBP7、cyclin D1、CDK4、cyclin E、CDK2、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p53 和 Rb 条带分别与内参照蛋白β－actin条带的灰度值之比代表其蛋白表达水平。

4 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据用均数±标准差()表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 酶切质粒pCMV6－IGFBP7及制备空质粒

质粒pCMV6－IGFBP7经Sgf I和Not I酶切后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，全自动凝胶成像系统检测显示，质粒pCMV6－IGFBP7长度为6 kb。酶切产生的pCMV6质粒片段和IGFBP7片段长度分别为4.9 kb和1.1 kb，与预期结果一致。空质粒为4.9 kb，见图1。

Figure1.Restriction endonuclease digestion of pCMV6－IGFBP7 and empty plasmid pCMV6.M:marker;A:pCMV6－IGFBP7;B:pCMV6－IGFBP7 digested by Sgf I and Not I;C:empty plasmid pCMV6.图1 质粒pCMV6－IGFBP7酶切结果与空质粒pCMV6

2 IGFBP7的表达

Western blotting结果显示，control组、empty组和PD98059组均不表达IGFBP7蛋白，稳定转染pCMV6－IGFBP7质粒的IGFBP7组MCF－7细胞高表达IGFBP7蛋白，表明稳定表达IGFBP7蛋白的细胞系构建成功，见图2。

Figure2.Expression of IGFBP7 protein in different groups.图2 IGFBP7蛋白在各实验组中的表达

3 软琼脂克隆形成实验

IGFBP7组细胞的CFE为2.92% ±0.36%，均显著低于其它各组(P＜0.01)。PD98059组细胞的CFE为7.56% ±0.69%，显著低于control组(P＜0.01)。Empty组CFE与control组相比无显著差异，见图3。

Figure3.Effect of IGFBP7 on colony－forming efficiency(CFE)of MCF－7 cells..n=5.△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P＜0.01 vs PD98059 group.图3 IGFBP7对人乳腺癌MCF－7细胞克隆形成率的影响

4 IGFBP7对细胞周期的影响

IGFBP7组G0/G1期细胞比例为77.69% ±2.17%，显著高于其它各组(P＜0.01)，S期和G2/M细胞比例分别为13.66%±1.18%和8.65%±0.99%，均显著低于其它各组(P＜0.01)。PD98059组G0/G1期细胞比例为66.03% ±2.04%，显著高于control组(P＜0.01)，但明显低于IGFBP7组(P＜0.01)，S期和 G2/M细胞比例分别为16.60% ±0.92%和17.37% ±1.12%，均显著低于 control组(P＜0.05)。Empty组G0/G1期、S期和G2/M细胞比例与control组相比无显著差异，见图4。

5 IGFBP7对ERK磷酸化的影响

PD98059组p－ERK1/2与ERK1/2灰度比为0.0710±0.0059，均显著低于其它各组(P＜0.01)。IGFBP7组p－ERK1/2与ERK1/2灰度比为0.2162±0.0168，明显低于 control组，见图5。

Figure4.Effect of IGFBP7 on cell cycle of MCF－7 cells measured by flow cytometry..n=5.△P＜0.05，△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P＜0.01 vs PD98059 group.图4 IGFBP7对人乳腺癌MCF－7细胞周期的影响

6 IGFBP7 对 cyclin D1、CDK4、cyclin E、CDK2、p27KIP1、p21CIP1/WAF1、p53、Rb 和 p －Rb 蛋白表达的影响

IGFBP7组 cyclin D1/β－actin的灰度比为0.4518±0.0267，显著低于 control组(P ＜0.01)，但与PD98059组相比无显著差异，cyclin E/β－actin和p－Rb/Rb的灰度比分别为 0.4006±0.0161和0.1512±0.0095，显著低于其它各组(P＜0.01)，p27KIP1/β －actin、p21CIP1/WAF1/β －actin 和 p53/β －actin的灰度比分别为 0.8744±0.0317、0.9229±0.0316和0.9481±0.0341，显著高于其它各组(P＜0.01)。PD98059组 p27KIP1/β－actin的灰度比为0.7332±0.0301，显著高于control组(P ＜0.01)，p－Rb/Rb的灰度比为0.3315±0.0194，显著低于control组(P ＜0.01)，cyclin E/β －actin的灰度比为0.8924±0.0304，与 control组相比无显著差异。Control组与empty组相比无显著差异。各组CDK4/β －actin、CDK2/β －actin和 Rb/β －actin的灰度比无显著差异，见图6、7。

Figure5.IGFBP7 and PD98059 decreased the phosphorylation of ERK1/2..n=5.△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P ＜0.01 vs PD98059 group.图5 IGFBP7和PD98059抑制ERK1/2的磷酸化

Figure6.Effects of IGFBP7 on expression of cyclin D1，CDK4，cyclin E and CDK2 in MCF－7 cells..n=5.△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P ＜0.01 vs PD98059 group.图6 IGFBP7对cyclin D1、CDK4、cyclin E和CDK2蛋白表达的影响

讨 论

RAS/RAF/MEK/ERK信号通路参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞恶变等多种生物学反应，是涉及调节细胞生长、分化及分裂信号网络的核心。大量来自生长因子、丝裂原、环境刺激等信号可激活 RAS/RAF/MEK/ERK信号通路，通过信号级联反应作用于核转录因子如AP－1、NF－кB等，调控基因表达。在许多人类的癌症(如口腔癌、黑色素瘤、乳腺癌等)中都可发现ERK1/2信号通路的过度激活[8－9]。本研究结果显示，人乳腺癌MCF－7细胞ERK1/2信号通路处于显著活化状态，而高表达IGFBP7可明显抑制ERK1/2磷酸化，这可能与IGFBP7上调RAF激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)有关[10]。

细胞增殖是通过细胞周期来完成的。细胞周期是多因子参与的高度精确和有组织的时序调控过程。细胞周期素(cyclins)、细胞周期素依赖性激酶(cyclin－dependent kinases，CDKs)和细胞周期素依赖性激酶抑制剂(cyclin－dependent kinase inhibitors，CDKIs)是细胞周期调控中的关键组分。Cyclin D1和cyclin E属细胞周期素家族成员，可分别与CDK4和CDK2结合并激活其活性，调控细胞由G1期至S期的转变。Rb是cyclin D/CDK4和cyclin E/CDK2激酶的一种重要底物。高度磷酸化的Rb与E2F转录因子解离，使E2F得以活化，从而激活一系列下游事件，其中包括DNA的复制，使细胞从G1期进入S期。CDKIs根据结构和功能分为INK4家族和CIP/KIP家族。p21CIP1/WAF1和p27KIP1是CIP/KIP家族中的重要成员，它们可与G1/S期激酶复合物如cyclin D/CDK4和cyclin E/CDK2等紧密结合，抑制其活性，阻止细胞从 G1期进入 S期，过表达 p21CIP1/WAF1和p27KIP1均可使细胞停滞于 G1期[11－12]。

本研究发现，IGFBP7过表达既可显著抑制人乳腺癌MCF－7细胞cyclin D1和cyclin E的表达，又同时促进人乳腺癌 MCF－7细胞 p21CIP1/WAF1和p27KIP1蛋白表达，这样不仅可以减少cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2激酶复合物的形成，还能有效抑制已形成的cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2激酶复合物的活性，从而抑制了Rb磷酸化和E2F活化，最终阻止人乳腺癌MCF－7细胞从G1期进入S期。

Figure7.Effects of IGFBP7 on expression of p21CIP1/WAF1，p27KIP1，p53，Rb and p－Rb in MCF－7 cells..n=5.△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P ＜0.01 vs PD98059 group.图7 IGFBP7对p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p53、Rb和p－Rb蛋白表达的影响

本研究还发现，IGFBP7过表达可显著抑制ERK1/2信号通路的活化。为了探究ERK1/2信号通路是否参与了IGFBP7的细胞周期阻滞作用，在本研究中我们使用了MEK1/2抑制剂PD98059以观察ERK1/2信号通路对MCF－7细胞增殖的影响。结果发现，PD98059诱导了一些与IGFBP7相似的作用，如阻滞MCF－7细胞于G1期，下调cyclin D1和上调p27KIP1的表达。这提示IGFBP7可能是通过抑制ERK1/2信号通路的活化影响cyclin D1和p27KIP1的表达，然而IGFBP7对p21CIP1/WAF1和cyclin E的表达调控似乎与ERK1/2信号通路无关。

为了进一步探究IGFBP7对p21CIP1/WAF1的表达调控机制，我们观察了IGFBP7对p21CIP1/WAF1上游基因p53的表达影响。结果发现，IGFBP7可上调p53的表达。这提示IGFBP7可能是通过上调p53的表达进而促进p21CIP1/WAF1的表达。但IGFBP7对于cyclin E的调控机制目前尚不清楚，尚不排除IGFBP7作为转录调节因子直接调控cyclin E表达的可能。

综上所述，IGFBP7抑制人乳腺癌MCF－7细胞增殖的机制可能与其抑制ERK1/2信号通路，上调p53、p21CIP1/WAF1和 p27KIP1，下调 cyclin D1 和 cyclin E表达，抑制Rb磷酸化有关，但其具体机制还有待进一步的探讨。

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