不同补肾方法减轻化疗后卵巢功能损害的比较研究*

秦佳佳，李瑞满，吴 倩

(暨南大学1医学院中医系，2第一附属医院，广东 广州 510632)

随着化疗的治疗进展，很多恶性肿瘤患者可以长期存活甚至治愈。但是化疗所引起的卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)而导致的早绝经和不孕影响了女性患者的生存质量。目前，国内外主要应用促性腺激素激动剂或雌、孕激素作为化疗中卵巢功能的保护药物[1－2]。但其长期应用是否能增加卵巢癌发生的机率尚存在争议，从而限制了其临床的实际应用及患者对其的接受程度。目前，应用中药制剂作为化疗后卵巢功能防护药物方面的研究尚属空白，亦是广大中医学工作者面临的重要课题。卵巢为女性内生殖器官，而“肾主生殖”，主宰着“肾－天癸－冲任－胞宫”之间的协调，使其“有子”或“无子”。故防护化疗导致的卵巢储备功能下降应从调补肾阴入手[3]。有学者运用补肾方法治疗去卵巢后骨质疏松，取得满意效果[4]。本课题组前期研究亦显示，补肾中药能提高大鼠体内促性腺激素释放激素(gonadotropin －releasing hormone，GnRH)、黄体生成激素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)和孕酮(progesterone，P)的水平，使子宫和卵巢重量增加，组织形态改善。说明补肾中药对大鼠卵巢功能有改善作用[5－7]。六味地黄丸、金匮肾气丸分别为调补肾阴、肾阳的经典方剂，本项目拟从卵巢形态、卵巢内分泌功能、卵巢相关抗体等方面的变化，观察上述两种不同补肾方法对化疗后损害的卵巢功能是否具有修复作用，从现代医学角度，进一步探讨中医“肾主生殖”的理论实质。

材料和方法

1 药物

六味地黄丸(组成:熟地黄、制山茱萸、山药、牡丹皮、茯苓和泽泻，每8丸相当于原生药3 g)由江苏康缘药业股份有限公司提供，国药准字070426。金匮肾气丸(组成:熟地黄、山药、制山茱萸、茯苓、牡丹皮、泽泻、桂枝、制附子、牛膝和车前子，每8丸相当于原生药3 g)由北京同仁堂科技发展股份有限公司提供，国药准字Z11020147。

2 动物

纯种SD大鼠，清洁二级，雌性，体重150～250 g，月龄2～4个月，由广州中医药大学动物实验中心提供。动物合格证号为粤监证字2008A002。

3 试剂

雌二醇(estrogen，E2)、FSH和抗卵巢抗体(antiovarian antibodies，AoAb)酶联免疫试剂盒，由Rapid Bio生产。

4 仪器

酶标仪由Thermo Fisher Scientific生产，型号为Multiscan MK3。

5 方法

5.1 造模及给药 60只大鼠随机分为4组，给药方法如下:A组:腹腔注射生理盐水，每次每只动物2 mL，共15 d，之后生理盐水灌胃，每次每只动物2 mL，连续灌胃28 d;B组:腹腔注射环磷酰胺(cytoxan，CTX)，第1 d腹腔注射12 mg，其后腹腔注射2 mg，连续14 d，其后生理盐水灌胃，每次每只动物2 mL，连续灌胃28 d;C组:腹腔注射CTX，第1 d腹腔注射12 mg，其后腹腔注射2 mg，连续14 d，造模成功后，行六味地黄丸灌胃，每次每只动物2 mL，连续28 d;D组腹腔注射CTX，第1 d腹腔注射12 mg，其后腹腔注射2 mg，连续14 d，其后给予金匮肾气丸灌胃，每次每只动物2 mL，共灌胃28 d。

5.2 检测指标

5.2.1 HE染色 随机选取一侧卵巢，用10%中性甲醛固定24 h，石蜡包埋，常规石蜡包埋，切片，观察卵巢大体形态。每只大鼠一侧卵巢各取6张切片，在光学显微镜(100倍)下计数各级卵泡及黄体数量，取平均值。

5.2.2 血清内分泌激素水平 取血并分离血清后，置－20℃冰箱保存，采用酶联免疫吸附法同批检测血清中的性六项水平，具体步骤按试剂盒操作说明进行。

5.2.3 抗卵巢抗体检测 酶联免疫吸附法检测血清中AoAb表达。

6 统计学处理

应用统计软件SPSS 11.5.0进行数据分析，数据以均数±标准差()表示，组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HE染色结果

从图1、表1可见，青年对照组显示卵巢内各级卵泡及黄体数量丰富，形态正常，未见淋巴细胞浸润(图1A)，与模型组比较，差异显著(P＜0.05，P＜0.01);模型组(图1B)除闭锁卵泡数量明显高于其余各组外(P＜0.05，P＜0.01)，其它各级卵泡及黄体均明显低于青年对照组，差异显著(P＜0.01);治疗后，补肾阴组及补肾阳组的原始卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡、成熟卵泡及黄体数量均增加，而闭锁卵泡数量降低，其中在原始卵泡、窦前卵泡的增加及闭锁卵泡数量下降方面，补肾阴组优于补肾阳组(图1C、D)。

2 各组大鼠血清性激素的变化

模型组大鼠从给药后第2 d起，E2水平即开始下降，与青年对照组比较，差异显著(P＜0.05，P＜0.01);其后随时间推移，模型组E2呈持续下降趋势，而补肾方药组E2下降较缓慢，尤其补肾阴E2下降速度慢于补肾阳组;造模组血清中FSH浓度持续升高，到造模第30 d，FSH升高较明显，其中以模型组升高最明显，补肾阴组FSH升高速度慢于补肾阳组，见表2。

Figure1.Histomorphological changes of the ovaries in rats from different groups(HE staining，×100).A:control group;B:CTX group;C:CTX+reinforcing the kidney－Yin group;D:CTX+reinforcing the kidney－Yang group.图1 各组大鼠卵巢组织形态学变化

表1 各级卵泡及黄体HE染色结果Table1.The number of follicles in every stage and corpora lutea observed by HE staining

表2 各组大鼠不同时点血清E2和FSH的变化Table2.Serum FSH and E2levels in rats at different time points(.n=15)

表2 各组大鼠不同时点血清E2和FSH的变化Table2.Serum FSH and E2levels in rats at different time points(.n=15)

▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs CTX group.

E2(ng/L)FSH(IU/L)Group 0 d 14 d 30 d 0 d 14 d 30 d Control 59.68 ±5.75# 59.30 ±5.02# 60.55 ±5.50# 0.15 ±0.03 0.15 ±0.20# 0.14 ±0.03#CTX 54.36 ±2.84▲ 45.82 ±3.23▲▲ 34.26 ±4.94▲▲ 0.26 ±0.29 0.25 ±0.03▲▲ 0.43 ±0.05▲▲CTX+reinforcing the kidney－Yin 53.46±4.02▲▲ 49.49±3.38▲▲ 51.65±4.75▲▲## 0.16±0.03 0.21±0.03▲▲# 0.19±0.03▲▲##CTX+reinforcing the kidney－Yang 53.97±3.30▲ 47.10±3.00▲▲ 42.65±2.85▲▲## 0.17±0.02 0.23±0.04▲▲ 0.40±0.02▲▲#

3 抗卵巢抗体变化情况

从表3可见，模型组AoAb明显高于其余各组，差异显著(P＜0.05，P＜0.01)，应用补肾药后，AoAb明显下降，但以补肾阴组下降明显，与模型组比较差异显著(P＜0.01)。

讨 论

本实验旨在探讨不同补肾方法对化疗后卵巢功能损害防护作用的影响及机制。实验结果显示，应用化疗药物后，模型组卵巢内各级卵泡及黄体数明显下降，血清E2水平明显下降，FSH水平明显上升，血清抗卵巢抗体水平明显升高，符合卵巢早衰的特征，造模成功，与文献报道相符[8]。血清E2主要来源于卵巢颗粒细胞，是观察卵巢储备功能的直接指标。在对卵巢储备的评价中，将血清E2与FSH水平结合起来，能够很好地评价卵巢的储备能力。本实验分别采取滋补肾阴和温补肾阳的方法对造模后大鼠进行干预，结果显示，补肾阴组及补肾阳组在用药后第30 d，E2水平均较模型组明显上升，FSH数值均有所下降，但在补肾阴组下降较显著。说明补肾方药可以对化疗所导致的卵巢功能损伤起到修复作用，增强卵巢储备能力，尤其以补肾阴组效果明显。用药后两组各级卵泡数及黄体数量均较模型组明显增加，说明补肾方药对卵巢功能保护作用机制可能是通过抑制颗粒细胞的凋亡、减缓卵泡的闭锁，从而达到卵泡对CTX的敏感性降低的作用。

表3 各组抗卵巢抗体变化Table3.Comparison of serum AoAb level in rats from various groups()

表3 各组抗卵巢抗体变化Table3.Comparison of serum AoAb level in rats from various groups()

▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs CTX group.

Group n AoAb Control 10 0.79 ±0.06 CTX 9 1.68 ±0.08▲▲CTX+reinforcing the kidney－Yin 10 0.95 ±0.29▲##CTX+reinforcing the kidney－Yang 8 1.51 ±0.11▲▲#

抗卵巢抗体是一种位于卵巢颗粒细胞、卵母细胞、黄体细胞和间质细胞内的自身抗体。该抗体的产生原因尚不是很清楚，在感染、创伤、反复穿刺取卵或促排卵药物的作用下，造成大量卵巢抗原释放，刺激机体产生抗卵巢抗体。抗卵巢抗体可能通过阻碍卵母细胞成熟，使卵母细胞数量减少，影响雌孕激素的产生，降低卵巢的生殖内分泌功能[9]。实验结果显示，补肾方药可以使抗卵巢抗体表达下降，这可能是补肾方药对卵巢功能保护作用的靶点之一，但其确切机制需要进一步探讨。

化疗在致病性质上属热邪，由内而散外，多伤及气血、脏腑。化疗后绝大多数病人表现为肝肾阴虚，以肾阴不足为主。特别是化疗后期，气阴两伤，临症所见低热、乏力、头晕耳鸣、盗汗、腰膝酸软、手足心热、鼻衄、齿衄、口渴、便干、舌红、苔少、脉细数，均为肝肾阴虚之证。卵巢为女性内生殖器官，而“肾主生殖”，主宰着“肾－天癸－冲任－胞宫”之间的协调，使其“有子”或“无子”，故防止化疗导致的卵巢功能损害应从补肾，尤其是调补肾阴入手。本实验结果证明补肾阴药物对卵巢功能的保护作用优于单纯补肾阳，为以后指导临床用药提供了一定的指导意义。

[1]Blumenfeld Z，Eckman A.Preservation of fertility and ovarian function and minimization of chemotherapy－induced gonadotoxicity in young women by GnRH － a[J].J Natl Cancer Inst Monogr，2005，2005(34):40 －43.

[2]彭 萍，杨冬梓，郑澄宇，等.促性腺激素释放激素类似物对化疗大鼠卵巢功能损害的干预作用[J].中华妇产科杂志，2007，42(8):546 －550.

[3]杨兰英.六味地黄丸治疗卵巢早衰的实验研究[J].山西中医学院学报，2002，3(1):1 －3.

[4]黎 波，张荣华.益骨胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织cbfα－1 mNRA表达的影响[J].中国病理生理杂志，2008，24(4):759 －762.

[5]秦佳佳.中成药坤宁安调控围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡因子Bcl－2 mRNA表达的特点[J].中国临床康复，2006，10(19):149 －151.

[6]秦佳佳.中西医结合疗法治疗卵巢早衰72例临床观察[J].四川中医，2006，24(8):86 －87.

[7]秦佳佳，陈慧铮，田旭升，等.“坤宁安”对围绝经期大鼠卵巢功能的影响[J].中医药信息，2004，21(6):47－48.

[8]岳连虎，韩 波.卵巢早衰与自身免疫指标的相关性研究[J].国际检验医学杂志，2009，30(3):267 －268.

[9]朱 玲，罗颂平，许丽绵，等.左归丸对小鼠自身免疫性卵巢损伤的保护作用[J].中国中西医结合杂志，2005，25(10):920－923.