HPLC法测定肾乐胶囊中橙皮苷的含量

白 林，郭兴道，任 韡（.解放军总医院药品保障中心药检室，北京 00853；.河北北方学院，河北 张家口 075000）

肾乐胶囊为解放军总医院非标制剂，由水蛭、陈皮等五味中药材加工制成，具有活血化瘀、益气养血、健脾利湿的功效，常用于慢性肾小球肾炎，证属气虚血瘀夹水湿者。方中陈皮味辛、苦，性温，入脾、肺经，其功能为理气健脾，燥湿化痰[1]。陈皮中含多种挥发油及黄酮类物质[2]，尚未建立其含量测定质量控制标准。本实验采取HPLC法对肾乐胶囊中陈皮的主要成分橙皮苷进行含量测定，此法简便、准确、重复性好，为有效控制肾乐胶囊的质量提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司，含四元梯度泵、自动脱气机、VWD检测器和化学工作站）；CX-300型超声波清洗机（北京市天海双龙医疗器械有限责任公司）；UV-2550型紫外分光光度仪（日本岛津）。

橙皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110721-200613）；甲醇为色谱纯；水：重蒸水。肾乐胶囊（解放军总医院，规格：0.45 g/粒，批号100601，101215，110512）。

2 方法

2.1 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），甲醇-水（40∶60）为流动相，检测波长283 nm，柱温为35 ℃，流速1.0 mL·min-1，进样量为10 μL。理论塔板数按橙皮苷峰计算不低于3000[3]。

2.2 溶液的制备

对照品溶液：取橙皮苷对照品约0.013 35 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得储备液（0.534 mg·mL-1）；精密量取上述储备液2 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（42.72 μg·mL-1）。

供试品溶液：取装量差异项下的肾乐胶囊内容物适量，研细，取粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理[4]30 min，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

阴性空白对照液：按处方比例称取除陈皮以外的其余药味，按肾乐胶囊制备工艺制成缺陈皮的阴性空白对照液，按供试品溶液制备方法制成阴性对照液。

2.3 系统适用性实验

取对照品溶液、供试品溶液、缺陈皮阴性空白对照液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，色谱图见图1。

图1 橙皮苷色谱图Fig 1 Chromatograms of Hesperidin

2.4 线性关系考察

精密吸取对照品储备液（0.534 mg·mL-1）0.16，0.32，0.64，1.28，1.6 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度并摇匀，得到浓度分别为8.544，17.09，34.18，68.35，85.44 μg·mL-1的系列对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积值为纵坐标（Y），进样浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，得到回归方程：Y= 17.026 4X+ 2.667 3，r= 0.999 9。结果表明，橙皮苷在8.544 ～85.44 μg·mL-1时，与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验

按上述色谱条件，精密吸取对照品溶液10 μL，连续重复进样5次，记录峰面积值，平均值为765.2，RSD为0.12%（n= 5）。说明仪器的精密度良好。

2.6 重复性实验

取本品（批号100601）粉末，按供试品溶液方法制备供试品溶液，按色谱条件检测，精密吸取供试品溶液10 μL，注入色谱仪，共进样5次，记录峰面积，平均值为548.88，RSD为0.19%（n= 5）。表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性实验

取本品（批号100601）粉末，按供试品溶液方法制备供试品溶液，按色谱条件，精密吸取供试品溶液10 μL，分别在0，4，8，12，16，24 h进样。记录峰面积值，平均值为514.05，RSD为1.26%。表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.8 回收率实验

取6份已知含量的肾乐胶囊（批号100601）内容物适量，每份约1 g，研细，精密称定，分别加入编号1～6的具塞锥形瓶中，分别精密加2 mL对照品储备液（浓度0.534 mg·mL-1）和48 mL甲醇，按供试品溶液制备方法，依色谱条件测定，记录色谱图及峰面积，计算回收率。结果平均回收率为101.6%，RSD为0.54%（n= 6），说明本方法的回收率良好，具体见表1。

表1 回收率实验测定结果Tab 1 Results of recovery test

2.9 样品含量测定

三批肾乐胶囊，批号分别为100601、101215、110512，取装量差异项下的内容物适量，按供试品溶液的制备及色谱条件进行检测，橙皮苷含量分别为2.76，2.83，2.67 mg·g-1（n= 3）。

3 讨论

3.1 溶剂的选择

对照品溶液曾用30%乙醇作为溶剂[5]，较难溶解，且放置过程中溶液混浊。后采用甲醇做溶剂，使该问题解决且超声可加速溶解，放置过程中稳定性好，峰面积无明显差异。供试品溶液用甲醇做溶剂比30%乙醇溶解性好，并且经实验比较提取率高。

3.2 检测波长的选择

取对照品溶液，在200～400 nm范围内扫描，最大吸收波长为283 nm，灵敏度高、无其他杂质峰干扰。

3.3 流动相的选择

以甲醇-水（25∶75）[6]、甲醇-水（40∶60）分别作为流动相进行比较，结果甲醇-水（40∶60）时，出峰时间适宜，峰形较好，无干扰。

3.4 不同批次样品含量的比较

本实验对橙皮苷含量测定具有准确、简便、重复性好等特点，方法专属性强，不存在其他组分干扰。三个批次的样品平均含量为2.75 mg·g-1，RSD =2.9%。说明在此加工工艺的条件下，橙皮苷含量较稳定，可检测橙皮苷含量作为检测肾乐胶囊的质量标准。

[1] 李庆耀，梁生林.陈皮的药用研究进展[J].中成药，2008，30（2）：246-248.

[2] 郑小吉，詹晓如，王小平.陈皮研究进展[J].中国现代中药，2007，9（10）：30-33.

[3] 敖辉，涂海龙.HPLC法测定蛇胆陈皮胶囊中橙皮苷的含量[J].江西中医药，2008，39（12）：75-76.

[4] 喻明洁，吕圭源， 陈素红.橙皮苷提取分离及检测方法研究进展[J].亚太传统医药，2011，7（5）：171-173.

[5] 谢东，路玫.HPLC法同时测定风寒感冒片中葛根素和橙皮苷的含量[J].广东药学院学报， 2009，25（1）：28-30.

[6] 杨华，何希荣，顾雪竹.HPLC 测定胆疏胶囊中橙皮苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：92-93.