人参提取工艺的优化及其有效成分与药效学相关性分析

王耀文， 孟宪生， 包永睿， 王 帅

(辽宁中医药大学，辽宁大连116600)

人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根。具有大补元气复脉固脱、补脾益肺、生津、安神之功效［1］。用于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴、内热消渴、久病虚赢、惊悸失眠、阳痿宫冷、心力衰竭、心源性休克等［2］。人参皂苷大多具有增加白细胞数量、提高人体免疫力、促进物质代谢、抗疲劳、抗衰老等作用［3］。本研究设计正交实验，以HPLC同时定量，优选出人参皂苷的提取条件，并以连二亚硫酸钠为造模药物，建立心肌细胞缺氧模型，以MTT测定心肌细胞存活率水平;考察所得优化工艺对心肌细胞的保护作用，确保疗效，为人参临床疗效的发挥建立有效保障。

1 材料

1.1 仪器与药材

Agilent1100-DAD液相色谱仪;CP225D电子分析天平(德国Sartorius，十万分之一);微量移液器 (法国吉尔森科技有限公司);MiLLi-Q超纯水处理装置 (美国MiLLipore公司);AE31型倒置相差显微镜 (Motic公司);UNRISE酶标仪 (瑞士TECAN公司)。

人参药材由大连市开发区阳光大药房够买，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为 Panax ginseng C.A.Mey.;人参皂苷 Rb1、Re、Rg1(批号分别为 110704-200420、110754-200320、110703-200726，购自中国药品生物制品检定所)。

1.2 动物 新生SD乳鼠 (1～3d)，购自大连医科大学实验动物中心，达到国家清洁级标准，合格证号为SCXX(辽)-2008-0002。

2 方法与结果

2.1 正交实验法优选人参提取工艺 选择提取时间、提取次数、溶剂用量、溶液含醇量4个因素，对主要影响因素各取3个水平，进行L9(34)正交试验考察，优选最佳提取条件［4-6］。每份取等量人参粉末，用乙醇回流提取，过滤，滤液减压回收乙醇，减压干燥得干膏。按下述方法分别制备样品溶液并进行测定。

2.2 色谱条件与系统适用性试验［7］Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为水 (A)-乙腈 (B)，二元线性梯度洗脱0～25 min:22%→23%B(78%A→77%A);25～28 min:22%B→ 30%B(77%A→70%A);28～60 min:30%B→34%B(70%A→66%A);60～80 min:34%B→40%B(66%A→60%A);80～90 min:40%B→50%B(60%A→50%A);90～100 min:50%B→60%B(50%A→40%A);体积流量1 mL/min;柱温25℃;检测波长203 nm;进样量15 μL。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品适量，加甲醇制成含 Rg10.218 mg/mL，Re 0.252 mg/mL，Rb10.366 mg/mL的混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备 精密吸取人参提取液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.5 细胞实验处理

2.5.1 原代乳鼠心肌细胞的培养［8-9］取新生SD乳鼠若干只，无菌条件下开胸取心，用PBS液洗净。并在适量冷PBS中将心室剪成碎块放入培养皿里，用混合消化液多次消化，用培养液终止消化，离心，沉淀物加入培养液过200目筛，收集细胞悬液，以差速贴壁法分离纯化心肌细胞，用培养液调整细胞浓度，转接于96孔板里培养，获得较纯的心肌细胞，再继续培养。选生长状态佳者于72 h后进行实验。

2.5.2 含药血浆的获得 将小鼠随机分为10组，一组空白对照组，其余9组为正交试验组。灌胃3 d，眼球取血，置Ep管中，离心，吸取上清液即为含药血浆，经56℃30 min灭活处理后，用微孔滤膜过滤除菌，置－20℃保存备用。

2.5.3 分组 取接种完成的96孔板的心肌细胞随机分为10组 (每组5孔细胞):①对照组:细胞板中加入Na2S2O437℃培养1 h，换入正常培养液复氧1 h后，培养24 h;②9组正交试验组:含药血浆 +Na2S2O4组，Na2S2O4培养1 h，正常DMEM/F12培养液复氧1 h后，加入含药血浆37℃培养24 h。

2.5.4 MTT法测定心肌细胞活力［10］将心肌细胞接种于96孔板中，经上述实验分组处理后，每孔避光加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，37℃继续孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μLDMSO，振荡10 min，使结晶物完全溶解。于波长492 nm处测各孔OD值，计算细胞活力，见表1［11］～2。

表1 人参正交试验

表2 方差分析

以直观分析表1及方差分析表2对实验结果进行评价，结果表明，影响提取工艺的因素主次顺序为B＞D＞C＞A，其中提取次数 (B)对药材提取率影响最大，具有显著性意义 (P＜0.05)。因此筛选确定提取条件为A2B3C2D3，即以8倍量80%乙醇回流提取3次，每次1 h。

2.6 正交验证试验 为了认证A2B3C2D3结果是否为最佳提取工艺，分别称取3份等量人参，按照人参正交试验中最佳提取工艺进行提取，其有效成分测定与药效学试验同上，结果见表3。经过药效学与有效组分结合筛选出的结果与正交试验得到的最佳提取工艺完全一致，因此本次试验的最佳提取工艺结果为A2B3C2D3，且药效学结果稳定。

表3 人参最佳提取工艺验证结果

2.7 相关性分析 通过SPSS 17.0软件将9组样品的人参皂苷Rg1、Re、Rb1含有量分别与细胞存活率进行Pearson相关系数分析，结果见表4。

表4 相关性分析

人参皂苷Rg1、Re、Rb1含有量与存活率均呈正向直线相关，3种人参皂苷与存活率相关性为Rg1＞Rb1＞Re。

3 讨论

3.1 中药的有效成分复杂，在试验过程中，由于人参的成分颇多，有皂苷类、有机酸类、脂类等成分构成，这些成分对总皂苷药效的影响并不清楚，若单纯以人参化学指标和总皂苷产率的高低来优选最佳提取工艺，已不能说明所提取成分药效是否最佳。因此，本实验采用将人参提取工艺与药效双重指标相结合的方法，使优选出的提取工艺更加有依据。验证实验表明，本实验通过将活性成分和药效相结合的方法使中药提取产物突出其某方面疗效，并反映出本研究的设计方法和技术路线是科学、合理、必要和可行的，为中药提取工艺的优化提供了一种新的思路。

3.2 采用了正交试验进行人参提取工艺的优选，正交设计具有“均匀分散，整齐可比”的特点，可减少试验次数，避免众多交互作用的解释困难。与以往正交试验单一的考察指标相比，本研究选择多种活性成分作为指标，建立合理的关联，并设不同权重系数来区分因素水平间差别，更好地达到了工艺优化的目的。验证结果表明，这种设计方法是科学、合理、可行的。

3.3 本实验直接应用Na2S2O4作用于原代心肌细胞，Na2S2O4作为一种氧清除剂，不仅不会损伤细胞膜，且一般在给予适当剂量下即可清除培养基中的氧，造成心肌细胞缺氧，可更好的建立心肌细胞缺氧/复氧模型，并通过MTT比色分析法测定活细胞数，其操作简单，客观准确，能反映细胞与药物的关系，便于实验室开展。

3.4 本实验对人参中3种皂苷成分与心肌细胞存活率进行相关性分析，证明人参中3种皂苷成分是治疗心肌缺氧的有效成分，以3种皂苷成分作为评价人参提取工艺的指标成分是合理的，并为以化学成分作为提取工艺的评价指标提供了理论依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:8.

［2］毛祖林，李晓波，龚文明，等.人参皂苷提取工艺优选［J］.时珍国医国药，2008，19(11):2762-2763.

［3］杨丽玲，吴 铁.不同粉碎度对人参皂苷3种不同单体提取率影响［J］.长春中医药大学学报，2009，25(5):669-670.

［4］李卓艳，李德坤，周大铮，等.正交试验法优选红参加工工艺［J］.中成药，2011，33(6)1005-1007.

［5］郝少君，张正臣.正交设计法研究人参皂苷的最佳提取工艺［J］.中华医学实践杂志，2007，6(1):48-50.

［6］黄春青，林亚平，靳凤云，等.均匀设计法结合药效学指标优选金铁锁提取工艺［J］.中国中药杂志，2008，33(15):1817-1820.

［7］王晓燕，朱宝珠.HPLC测定脑脉舒康胶囊中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16(13):56-58.

［8］许 浩，葛亚坤，邓同乐，等.人参皂苷Rb1对H2O2诱导大鼠心肌细胞凋亡的保护作用［J］.中国药理学通报，2005，21(7):803-806.

［9］丁云录，陈 声，宋 宇，等.武皂荚皂苷对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用［J］.中药新药与临床药理，2007，18(6):442-444.

［10］周晓慧，龚明玉，闫凤霞.灯盏花素对缺氧/复氧诱导培养乳鼠心肌细胞凋亡的抑制作用［J］.中成药，2009，31(12):1823-1827.

［11］王宁宁，焉媛媛，李 月，等.不同提取方式对天麻复方中药的药效学影响［J］.中药材，2007，30(4):452-454.