肾炎康复片对实验性糖尿病肾病大鼠药效作用研究

王 蕾， 苗淑杰， 李 旭， 种影影， 王 佳， 陈卫平

(1.天津市医药科学研究所，天津300020;2.天津同仁堂股份有限公司，天津300381)

肾炎康复片是天津同仁堂股份有限公司研制的国家级新药，主治慢性肾小球肾炎属于气阴两虚、脾肾不足、毒热未消证者，表现为神疲乏力，腰腿酸软，面浮脚肿，头晕耳鸣，蛋白尿，血尿等。有临床报道，肾炎康复片对糖尿病肾病 (DN)亦有明显治疗作用，可有效控制血糖［1］，减少尿蛋白排泄量，减轻水肿症状［2］。本实验旨在运用药理学实验方法，观察肾炎康复片对实验性糖尿病肾病大鼠的治疗作用，并揭示其对糖尿病肾病病变靶器官肾脏功能改善作用。

1 实验材料

1.1 实验动物及饲料 Wistar大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。许可证编号:SCXK(京)2007-0001。

普通全价颗粒饲料Ⅱ号，由北京科澳协力饲料有限公司生产，京动许字 (2000)第015号。动物饮用纯净水。

1.2 实验药物 肾炎康复片 (由天津同仁堂股份有限公司提供，批号:B81003)，每克药粉含2.5 g生药。将肾炎康复片药粉用纯净水配制成0.6、0.3、0.15 g生药/mL的肾炎康复片药粉混悬液待用;盐酸吡格列酮片 (北京太洋药业有限公司，批号:070201);链脲佐菌素 (STZ)(北京市博爱科贸有限责任公司分装Sigma-S0130)。

1.3 实验设备 全自动生化仪 (SaBa18);紫外分光光度计 (岛津UV-260);离心机 (80-1，上海手术器械厂);恒温水浴箱 (S648，上海医疗器械厂);大鼠代谢笼。

1.4 实验用试剂盒 糖化血红蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号:20070713);尿蛋白定量试剂盒 (南京建成生物工程研究所，批号:20070714);肌酐试剂盒测定法 (中生北控生物科技有限公司，批号:070821);葡萄糖液体试剂盒 (中生北控生物科技有限公司，批号:070861)。

2 实验方法

2.1 动物分组及模型的建立［3-5］大鼠经背部切口行右肾切除术，假手术对照组仅对皮肤和肌肉进行切开、缝合操作，不切除肾脏。2周后，经尾静脉注射 STZ 1次 (35 mg/kg，溶于 pH 4.5、0.1 mol/L枸橼酸缓冲液中)诱导糖尿病肾病模型，假手术对照组仅注射等体积的枸橼酸缓冲液。72 h后，空腹眼眶内眦采血测血糖，将血糖≥11.1 mmol/L为模型入选标准，然后按照血糖值将大鼠随机分成模型对照组、盐酸吡格列酮10 mg/kg对照药组、肾炎康复片6、3、1.5 g生药/kg三个剂量组，相当于临床人用剂量的30、15、7.5倍。

2.2 实验方法 各组大鼠每日灌胃相应药物1次/d，给药体积10 mL/kg，假手术与模型对照组分别灌胃等体积纯净水，共11周。实验结束前，代谢笼收集24 h尿液，量取尿量后，2000 r/min离心10 min，去沉淀，－20℃保存待测尿肌酐、尿蛋白水平。用戊巴比妥钠 (45 mg/kg)腹腔麻醉，腹主动脉取血测定血糖、糖化血红蛋白、血清肌酐、血清尿素氮。取左侧肾脏，剥离被膜后，用17%的福尔马林液固定，常规制片，光镜检查，测量肾小球直径和面积。

2.3 统计方法 所得数据均经SPSS11.5统计软件多组间方差分析，以均数±标准差 (±s)表示。

3 实验结果

3.1 肾炎康复片对糖尿病肾病大鼠血糖、糖化血红蛋白的影响 糖尿病肾病模型对照组Glu和HbA1c与假手术对照组比较明显升高 (P＜0.001，P＜0.001);肾炎康复片6 g生药/kg组大鼠Glu和HbA1c比模型对照组明显降低 (P＜0.01，P＜0.05)。数据见表1。

表1 肾炎康复片对糖尿病肾病大鼠血糖、糖化血红蛋白的影响(±s)Tab.1 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on Glu，HbA1c in rats(±s)

表1 肾炎康复片对糖尿病肾病大鼠血糖、糖化血红蛋白的影响(±s)Tab.1 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on Glu，HbA1c in rats(±s)

注:模型对照组与假手术对照组t检验，△△△P＜0.001;各给药组与模型对照组方差分析，★P＜0.05，★★P＜0.01。

组 别 动物数/只(mmol·L )(HbA1c)/(g·mL )10 8.60± 2.20 28.24±3.0810 28.18±10.93△△△ 37.73±2.58△△△10 24.21± 9.72 33.82±2.70★10 12.42± 8.05★★ 33.90±2.87★10 22.71±12.82 35.26±3.6010 18.09± 9.35 34.90±2.90血糖(Glu)/－1糖化血红蛋白－1假手术对照组肾炎康复片6 g生药/kg组模型对照组盐酸吡格列酮10 mg/kg组肾炎康复片1.5 g生药/kg组肾炎康复片3 g生药/kg组

3.2 肾炎康复片对糖尿病肾病大鼠肾功能的影响糖尿病肾病模型对照组血清BUN、Scr水平明显升高 (P＜0.001，P＜0.01)，表明肾功能受到严重损害;肾炎康复片6 g、1.5 g生药/kg组Scr较模型对照组明显降低 (P＜0.05，P＜0.05)，各剂量组血清BUN均有降低趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。数据见表2。

表2 对大鼠血清尿素氮、血清肌酐的影响(±s)Tab.2 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on BUN，Scr in rats(±s)

表2 对大鼠血清尿素氮、血清肌酐的影响(±s)Tab.2 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on BUN，Scr in rats(±s)

注:模型对照组与假手术对照组t检验，△△P＜0.01，△△△P＜0.001;各给药组与模型对照组方差分析，★P＜0.05。

组 别 动物数/只血清尿素氮(BUN)/(mmol·L －1)血清肌酐(Scr)/(mmol·L －1)假手术对照组10 21.40± 8.66 98.20±10.04肾炎康复片6 g生药/kg组10 5.70± 1.44 90.20± 6.66模型对照组 10 25.62± 8.67△△△ 107.60±15.59△△盐酸吡格列酮10 mg/kg组10 17.16±10.53 100.90±14.74肾炎康复片1.5 g生药/kg组10 19.08± 9.71 92.80± 9.45★肾炎康复片3 g生药/kg组10 17.33± 6.82 91.10± 6.35★

糖尿病肾病大鼠尿量明显增加 (P＜0.01)、尿肌酐水平明显降低 (P＜0.05)、尿蛋白水平明显增加 (P＜0.01)，表明其肾功能损害，肌酐清除功能降低，肾小球滤过膜功能和肾小管重吸收功能障碍使蛋白分子随尿液排出，形成蛋白尿。肾炎康复片各剂量组可使糖尿病肾病大鼠尿量减少、使尿肌酐水平有增加趋势，但无统计学差异 (P＞0.05)，肾炎康复片6 g生药/kg可使糖尿病肾病大鼠尿中蛋白水平明显降低 (P＜0.05)。数据见表3。

3.3 肾炎康复片对糖尿病肾病大鼠肾脏组织形态的影响 与假手术对照组比较，模型对照组肾脏病变显著，多数肾小球直径明显增大，可见肾小球基底膜增厚，系膜细胞增生;多数大鼠肾小管上皮细胞肿胀，空泡变性明显，尤以远曲小管为著。与模型对照组比较，给药组均有不同程度改善，肾病变显著减轻;多数动物肾小球直径增大不明显，肾小管空泡变性范围亦明显缩小。肾炎康复片6 g生药/kg组改善作用更为显著。数据见表4。

表3 肾炎康复片对大鼠尿量、尿肌酐、尿蛋白的影响(±s)Tab.3 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on VOL，Cr，Pro in rats(±s)

表3 肾炎康复片对大鼠尿量、尿肌酐、尿蛋白的影响(±s)Tab.3 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on VOL，Cr，Pro in rats(±s)

注:模型对照组与假手术对照组t检验，△P＜0.05，△△P＜0.01;各给药组与模型对照组方差分析，★P＜0.05。

组 别 动物数/只 尿量(VOL)/mL 尿肌酐(Cr)/(mol·L－1) 尿蛋白(Pro)/(ng·h－1·24－1)10 43.40±44.19 2558.60±1818.40 31.33±31.93模型对照组 10 115.30±62.10△△ 1019.40±295.46△ 102.33±52.33△△盐酸吡格列酮10 mg/kg组 10 133.00±29.76 1010.60±328.58 93.84±24.12肾炎康复片6 g生药/kg组 10 79.44±26.80 1605.90±1288.47 54.69±25.35★肾炎康复片3 g生药/kg组 10 110.30±33.01 1129.20±215.07 78.21±29.07肾炎康复片1.5 g生药/kg组假手术对照组10 98.10±32.29 1198.70±352.83 71.13±25.39

表4 肾炎康复片对糖尿病肾病大鼠肾脏组织病理的影响Tab.4 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on kidney pathology in rats(±s)

表4 肾炎康复片对糖尿病肾病大鼠肾脏组织病理的影响Tab.4 Effects of Shenyan Kangfu Tablets on kidney pathology in rats(±s)

注:假手术对照组与模型对照组t检验，△P＜0.05;各给药组与模型对照组方差分析，★P＜0.05，★★P＜0.01，★★★P＜0.001。

组 别 动物数/只指标肾小球直径/μm肾小球面积/(×102×μm2)假手术对照组10 90.9 ±6.3 74.6 ±11.7模型对照组 10 119.3 ±11.2△ 115.9 ±23.8△盐酸吡格列酮10 mg/kg组 10 100.0±10.6★★★ 88.0 ±15.1★★肾炎康复片6 g生药/kg组 10 104.3±8.4★★ 99.6±13.2肾炎康复片3 g生药/kg组 10 115.5±5.8 113.0±4.8肾炎康复片1.5 g生药/kg组 10 108.8±7.0★106.0 ±13.1

4 讨论

糖尿病肾病是临床常见和多发的糖尿病慢性并发症之一，主要指糖尿病肾小球硬化症，是以血管损害为主的肾小球病变。糖尿病早期肾体积增大，肾小球滤过率增加，呈高滤过状态，以后逐渐出现间隙蛋白尿或微量白蛋白尿，随着病程的延长出现持续蛋白尿、水肿、高血压、肾小球滤过率降低，进而可以发展为肾功能不全、尿毒症。

实验性糖尿病肾病可通过对大鼠体内注射链脲佐菌素 (STZ)进行复制，STZ的作用是破坏胰岛β细胞，使其丧失分泌功能，随着病程的进展形成糖尿病肾病。常用STZ腹腔注射剂量为60 mg/kg［6-9］，但造模周期较长，若合并一侧肾脏全部或部分切除术，可缩短实验周期，并减少STZ用量，使模型得以优化［10-11］。本实验采用右侧肾脏全切术合并STZ 35 mg/kg静脉注射的方法制备糖尿病肾病大鼠模型。糖尿病肾病大鼠出现多饮、多尿、消瘦等典型糖尿病消耗体征，血糖值和糖化血红蛋白明显升高，且11周内保持稳定，肾功能损伤明显，血肌酐、尿素氮明显升高，尿蛋白排泄量异常增高，尿肌酐明显降低，光镜下可见肾小球直径明显增大，基底膜增生增厚，肾小管上皮细胞肿胀。以上大鼠体征和数据表明，该方法制备的实验性糖尿病肾病模型是成功的，其症状明显，生化指标稳定，组织病理改变与临床糖尿病肾病病变机理模拟相似度较高，该方法可用于观察药物对糖尿病肾病的治疗及作用机制研究。

本实验数据表明，肾炎康复片对糖尿病肾病大鼠治疗作用是肯定的，其作用特点可从以下几方面分析:(1)降糖作用，有效控制血糖是防止和延缓糖尿病肾病发生和发展的关键因素。高血糖可引起肾脏一系列病理生理改变，包括糖化产物增加，肾小球滤过率增高，氧化应激增强，蛋白激酶和转化因子增强，这些都是导致肾小球损害的主要因素。除血糖指标之外，HbA1c亦是重要的糖尿病监控指标。HbA1c是血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物，该产物的结合是不可逆反应，并与血糖浓度成正比，且保持120 d左右，所以HbA1c最重要的意义在于，它可反映糖尿病患者近8～12周的血糖控制情况，不受偶尔一次血糖升高或降低的影响，现已作为国际公认的糖尿病监控“金标准”。肾炎康复片可使糖尿病肾病大鼠Glu和HbA1c有效降低，针对高血糖症这一最基本因素起到有效调控作用，是其延缓和治疗肾脏并发症的前提和先决条件。(2)改善肾功能，针对糖尿病并发的肾脏病变，肾炎康复片可直接作用于病变靶器官，通过干预治疗后，糖尿病肾病大鼠多尿、蛋白尿的症状均得到改善。血清肌酐明显低于模型对照组，尿肌酐的排泄功能亦有所改善，尿蛋白排泄量明显减少，这些数据均表明肾炎康复片对肾小球和肾小管的功能起到修复和改善作用。(3)肾脏组织形态，肾炎康复片给药组肾脏病变显著减轻，减轻程度有明显剂量—效应关系，6 g/kg组多数动物肾小球直径增大不明显，肾小球空泡变性范围亦明显缩小，改善效果最明显，其他剂量组亦有不同程度的修复作用。

通过本次实验表明，在实验性糖尿病肾病的基础上，可观察出肾炎康复片对糖尿病合并肾损伤有明显治疗作用，在有效控制高血糖症的同时，亦能延缓和改善糖尿病肾病的发展。

［1］苏文华，陈红转，张俊峰.肾炎康复片治疗糖尿病肾病的临床研究［J］.中国医药指南，2008，6(2):46-48.

［2］李 炜.肾炎康复片防治糖尿病肾病效果观察［J］.中国慢性病预防与控制，1998，6(4):201.

［3］李敬林，乔文军，郑曙琴，等.两种糖尿病肾病大鼠模型的比较［J］.辽宁中医杂志，2003，30(11):877-878.

［4］徐 颖，周世文，汤建林，等.实验性糖尿病肾病大鼠模型建立及优化［J］.第三军医大学学报，2006(22):145-148.

［5］余永梅，傅余芹，王春霞，等.颉沙坦联合丹参对糖尿病大鼠肾脏协同保护作用及机制［J］.深圳中西医结合杂志，2006，16(6):353-7.

［6］丁鹤林，徐明彤，陈黎红.洛沙坦降低糖尿病大鼠肾组织膜3型基质金属蛋白酶mRNA的表达［J］.中华内分泌杂志，2002，18(4):264-267.

［7］杨亦彬，张 翥，苏克亮.链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病肾病模型方法学探讨［J］.华西医学，2005，20(2):299-300.

［8］李 伟，张 红，殷松楼.不同剂量链脲佐菌素诱导SD大鼠糖尿病肾病模型的研究［J］.徐州医学院学报，2006，26(1):52-55.

［9］Wang Y，Li Q，Sun S Z，et al.Effects of benazcpril on renal function and kidney espression of matrix metalloproteinasc 2 and tissue inhibitor of metalloproteinasc-2 in diabetic rats［J］.Chin Med J，2006，119(10):814-821.

［10］查冬青，吴小燕，徐联芳.两种2型糖尿病肾病动物模型的比较［J］.武汉大学学报:医学版，2006，27(2):253-255.

［11］Takahashi H，Ichihara A，Kancshiro Y，et al.Regression of nephropathy developed in diabetes by pro-remmin receptor blockade ［J］. JAm SocNephrol，2007， 18(7):2054-2061.