乌头碱经皮给药的急性毒性及相关的镇痛作用研究

孙 虎， 王 平

(山东省中医药研究院药理研究室，山东济南250014)

乌头为毛茛科乌头属植物［1］。乌头碱具有很高的药用价值，广泛用于治疗多种疾病，在强心、镇痛、抗肿瘤、调节免疫等方面已显示了良好的应用基础［2］。然而因其口服毒性较大，临床应用受限而使基础研究非常薄弱［3］。乌头碱可以透过皮肤被吸收［4］，直接作用于治疗部位，提高了药物的生物利用度和使用安全性［5］。经检索，尚未发现乌头碱的外用限量，乌头碱类中药在外用时没有统一的标准，只能凭医师经验设定给药剂量，存在极大的安全隐患，同时乌头碱极易在组织腐败和碱性环境下被破坏，因而尸检时难以检测［6］。特别是关于乌头碱中毒的试验病理形态学研究，国内外报道很少。通过乌头碱透皮给药的急性毒性试验，为临床安全应用提供实验数据。

1 材料

1.1 动物 SPF级昆明种小鼠，体质量(20±2)g，雌雄各半 (购自山东大学试验动物中心，合格证号:鲁动质scxk(鲁)20090001号)。试验室温度为23～28℃，相对湿度50% ～70%，通风良好，喂以专用颗粒鼠饲料 (饲料:山东省试验动物中心提供)。

1.2 药品与试剂 乌头碱化学对照品 (纯度≥98.0%，HPLC)(由北京上立方联合化工技术研究院提供，编号:BW5271)。取适量乌头碱溶于60%乙醇溶液中，混匀，根据试验需要制成各种剂量溶液。冰醋酸 (分析纯)(天津市富宇精细化工有限公司，批号:110274)。60%乙醇溶液 (江津白酒厂出品，批号:060923)。

1.4 仪器 YB—6LF生物组织石蜡包埋机、YT—7F型生物组织摊烤片机、ZT—12P生物组织自动脱水机，湖北孝感亚光医用电子技术有限公司;LEICA—RM2135切片机、LEICA—DM/LS显微镜，德国LEICA公司。

2 方法

2.1 急性毒性试验给药剂量筛选、急性毒性试验根据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》，进行急性毒性试验给药剂量筛选和急性毒性试验。首先取昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，随机分组，每组5只。试验小鼠给药前12 h，禁食不禁水。试验采用小鼠外耳涂搽方式给药。给药后立即观察和记录试验小鼠的中毒症状及死亡情况。给药1 d后未死亡的动物按《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》描述的观察指征连续观察2周。各组小鼠于外耳处分别涂搽质量浓度为5.00、4.50、4.05、3.65、3.28 mg/mL乌头碱乙醇溶液;给药量分别为 2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mL/kg，空白对照组，在相同部位给予等剂量的赋形剂，记录各组小鼠给药后的活动及死亡情况;根据剂量筛选试验，确定以乌头碱3.00 mg/mL为初质量浓度，以0.85为等比系数向下稀释6个等级，给药容积为10.0 mL/kg，方法同上，每组10只，按照均衡随机原则分为30.00、25.50、21.70、18.40、15.60 mg/kg 5 个剂量组，剪取最高致死剂量、最低致死剂量和空白组的小鼠解剖，将取出小鼠心脏和脑组织，10%甲醛固定，常规石蜡包埋、固定、切片，进行HE染色，光镜下作组织病理学观察。

2.2 最小致死量以下累积透皮给药的毒性试验取昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，在最小致死剂量15.60 mg/kg下选取3个剂量［7-8］，随机分为10.00、12.50、15.00 mg/kg和空白对照4个剂量组，每组10只。分别每日给予各组小鼠外耳处涂搽乌头碱乙醇溶液，累积给药10 d，观察小鼠活动情况和死亡情况。

2.3 累积透皮给药对醋酸致小鼠扭体反应的影响取18～22 g健康小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，按高、中、低、阳性药、空白组分别于外耳处涂搽乌头碱药液质量分数为22.50、18.75、15.00 mg/kg的乌头碱液、扶他林、水，分别给药每日1次，连续给药3 d。第3天药后30 min，各只小鼠腹腔注射0.2 mL冰醋酸，观察15 min内扭体次数及扭体潜伏期，对试验数据进行组间t检验。

3 结果

3.1 剂量筛选试验、急毒试验结果 给药10 min左右，部分小鼠出现中毒症状，表现为身体僵直、活动剧烈、躁动不安、恶心、呼吸急促、颤抖，随后出现少动、四肢无力、走路摇晃、便溏;部分动物出现死亡。死亡小鼠的尸体表现为窄息征象，尸斑呈暗紫红色，口唇和指甲紫绀，有时口角可见流涎痕迹。解剖可见各脏器均表现出水肿，未见明显特异性毒理学变化。出现中毒症状但未死亡动物第2天仍旧便溏，第3天基本恢复，活动趋于正常，饮水吃食正常。继续观察2周未出现新的异常。表1结果显示，当小鼠给予乌头碱剂量在27.34 mg/kg及以上时，小鼠全部死亡，在27.34 mg/kg时死亡3只，在25.00 mg/kg时死亡4只，在22.50 mg/kg时死亡2只，在20.25 mg/kg时死亡1只，在 18.23 mg/kg时死亡 1只，在 16.41 mg/kg及以下时未见死亡，提示可以以27.34 mg/kg左右的剂量进行单次乌头碱透皮给药的正式急性毒性试验。

表1 乌头碱乙醇溶液经皮给药小鼠急性毒性剂量与死亡数关系Tab.1 Relationship between mortality and acute toxicity dosage of aconitine ethanol solution transdermal absorption on mice

药后10 min左右，部分小鼠出现中毒症状，表现为活动剧烈，躁动不安，身体僵直，呼吸急促，颤抖，一段时间后恶心，便溏，活动减少。表2显示，当小鼠给予乌头碱外用剂量在30 mg/kg时，小鼠死亡率为100%，在25.50 mg/kg时死亡率为80%，在18.40 mg/kg时死亡率为20%，在15.60 mg/kg时死亡率为0。根据动物死亡数，用Bliss法进行计算，LD50=21.3 mg/kg;LD50的95%可信限为19.6～23.2 mg/kg。正式试验与预试验中给药组动物的死亡时间比较一致，主要发生在给药后6～24 h。

表2 乌头碱乙醇溶液经皮给药途径小鼠急性毒性试验Tab.2 Acute toxicity test of aconitine ethanol solution transdermal absorption on mice

出现中毒症状但未死亡动物大多给药后第3天活动恢复，恢复后的小鼠未见抽搐、大小便失禁、嘶叫、烦燥不安或鼻、眼、口大量分泌物等现象，无异常病理性神经反射出现，继续观察2周未出现新的异常。给药后第14天称定体质量，各组小鼠之间无显著性差异。

将存活动物大体解剖，观察到部分小鼠脏器异常，可见坏死、出血、积液等病理改变。最高致死剂量30 mg/kg、最低致死剂量15.6 mg/kg和空白组小鼠的脑及心脏病理检测图1显示，给药后小鼠心肌出现心肌断裂、灶性出血，心肌细胞出现变形坏死，随着给药剂量的加重变性坏死程度进一步加重;小鼠神经元出现水肿、坏死，周围出现软化灶，变性坏死最重的反应区在海马区，部分细胞核出现分离。随着给药剂量的加大脑组织变性坏死程度也是进一步加重。

3.2 最小致死剂量以下乌头碱累积透皮给药对小鼠的毒性影响 给药10 min左右，部分小鼠出现中毒症状，表现为身体僵直、活动剧烈、躁动不安、恶心、呼吸急促、颤抖，随后出现少动、四肢无力、走路摇晃、便溏;未见死亡。出现中毒症状但未死亡动物第2天仍旧便溏，第3天基本恢复，活动趋于正常，饮水吃食正常。3 d以后部分小鼠活动反而更加活跃。第10天称定体质量，与空白对照组相比，给药组未见统计学上的显著性差异。处死小鼠，解剖，肉眼观察各脏器未见异常。乌头碱最小致死量以下的累积透皮给药，可致小鼠发生毒性反应，但随着用药次数的增加，毒性反应消失，小鼠逐渐恢复正常，出现“反转现象”。表3结果显示，3个剂量的乌头碱累积透皮给药，小鼠均无死亡现象。

图1 病理切片检查结果Fig.1 Results of pathological section

表3 乌头碱乙醇溶液累积经皮给药小鼠死亡情况Tab.3 Death records of mice offered aconitine ethanol solution by accumulatively transdermal absorption

3.3 乌头碱累积透皮给药对小鼠扭体次数的影响表4结果显示，乌头碱各剂量组均能显著延长0.6%醋酸所致小鼠扭体的潜伏期并减少扭体次数。潜伏期比较，高、中剂量组与空白对照组相比有显著性差异，扶他林组与空白对照组相比有非常显著性差异，低剂量组与扶他林组相比有显著性差异;扶他林组与空白对照组比较，扭体次数有显著性差异。通过潜伏期和扭体次数的比较可以发现，中剂量组镇痛效应接近高剂量组，提示当用量达到18.75 mg/kg时，乌头碱镇痛作用达到平台期。

表4 乌头碱对0.6%醋酸所致小鼠扭体反应的影响(±s，n=10)Tab.4 Aconitine's influence on twisting response for 0.6%acetic acid-induced mice(±s，n=10)

表4 乌头碱对0.6%醋酸所致小鼠扭体反应的影响(±s，n=10)Tab.4 Aconitine's influence on twisting response for 0.6%acetic acid-induced mice(±s，n=10)

注:与空白对照组比较，*P＜0.05，＊＊＊P＜0.001;与扶他林组比较，#P ＜0.05。

扭体次数空白对照组组 别 乌头碱剂量/(mg·kg－1) 潜伏期/s 330±30.5 35.60±2.40高剂量组 22.50 618±28.1* 17.40±5.68中剂量组 18.75 610±26.3* 16.50±4.86低剂量组 15.00 568±21.7# 24.90±5.78扶他林组 26.00 771±17.4＊＊＊ 9.20 ±3.71－*

4 讨论

中药的毒性是中药药性理论的核心之一，历来是一个重要的研究方向。辩证看待中药的毒性，辨证准确，配伍得当，便能化毒为利，正如《医法园通》中所讲“病之当服，附子、大黄、砒霜，皆是至宝;病之不当服，参、芪、鹿茸、枸杞，都是砒霜”。中医基础理论认为，中药治病基本原理在于其药物都具有各自的偏性，药物之所以能够治病，就是利用其偏性来祛除病邪，消除病因，协调脏腑功能，纠正机体阴阳偏盛偏衰，使机体恢复正常，因此以偏纠偏是中药治疗疾病的基本原理［9］。基于以上理论，毒性是乌头碱的偏性，亦为其有效性。

本试验通过考察乌头碱外用急性毒性，得到乌头碱单次给药的半数致死量LD50为21.3 mg/kg;LD50的95%可信限为19.6～23.2 mg/kg;在最小致死量以下选取3个药物剂量进行乌头碱累积外用考察，发现累积给药后小鼠仍旧发生毒性反应，但是随着用药次数的增加，毒性反应出现“反转现象”。同时，根据大体解剖中肉眼观察的病变和组织病理学检查的结果，初步判断可能的毒性靶器官是脑和心脏［10-12］。

在累积外用乌头碱对小鼠镇痛作用试验的基础上，发现乌头碱镇痛作用强度随着用药量的增加而加强;通过潜伏期和扭体次数的比较可以发现，中剂量组镇痛效应接近高剂量组，提示当用量达到18.75 mg/kg时，乌头碱镇痛作用达到平台期。研究表明乌头碱在外用镇痛方面有其独到之处，对慢性疼痛的止痛效果并不低于西药［13］，对中枢和外周疼痛都有抑制作用［14］，其镇痛作用强，且连续用药不易产生耐受现象［15］。本试验通过探讨乌头碱外用经皮给药的使用限量和镇痛作用，为今后乌头碱类中药的临床安全使用和基础研究提供试验数据参考。

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