参芍口服液对冠状动脉粥样硬化大鼠主动脉IL-8、VCAM-1和ICAM-1表达的影响

薛忠文， 董天崴， 张 琦， 徐丁洁， 王 晨， 尚小明*

(1.河北医科大学，河北石家庄050000;2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154002;3.河北医科大学附属唐山市工人医院，河北唐山063000)

冠心病作为一种系统性纤维增生炎症性疾病是导致中老年死亡的首要原因，据统计目前我国约有2000万人患有冠状动脉性疾病［1］。现代医学认为冠心病的发病基础为冠状动脉粥样硬化，治疗应当改变不良的生活习惯，戒烟，低脂饮食，减轻体质量，适当运动;药物如辛伐他汀、普伐他汀等副作用及长期应用的安全性有待进一步评估;介入治疗仍无法完全克服支架术后再狭窄、延迟性血栓问题。中医药在冠状动脉粥样硬化治疗中具有整体论治、辨证分治等特点，具有独特优势，已成为冠状动脉粥样硬化治疗中的一种新选择。本实验通过研究参芍口服液对冠状动脉粥样硬化模型大鼠血脂指标和主动脉IL-8、VCAM-1和ICAM-1表达的影响，探讨其抗动脉粥样硬化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠50只，鼠龄3个月，体质量150～180 g，由北京维通利华有限公司提供，清洁级动物，合格证号 SCXK(京):0175819，2010-0038。随机分为5组:正常组、模型组、治疗组 (参芍口服液高剂量组、参芍口服液低剂量组、辛伐他汀组)，每组各10只。

1.2 主要试剂 参芍口服液 (药物组成:丹参250 g，黄芪250 g，赤芍药150 g，当归150 g，川芎75 g，桃仁125 g，红花75 g，水蛭187.5 g，地龙250 g，清半夏125 g。河北省唐山市工人医院制剂室制备，制剂号:Z20050957，10 mL/支);维生素D3(上海通用药业股份有限公司);辛伐他汀(杭州默沙东制药有限公司);IL-8兔抗鼠多克隆一抗 (BA2189，北京博奥森生物技术有限公司);ICAM-1兔抗鼠多克隆一抗 (bs-1378R，北京博奥森生物技术有限公司);VCAM-1兔抗鼠多克隆一抗 (BA0406，武汉博士德生物技术有限公司);羊抗兔多克隆二抗 (北京博奥森生物技术有限公司);羊抗兔IgG-AP、免疫组化SABC试剂盒 (武汉博士德生物技术有限公司);DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 造模方法及分组 SD雄性大鼠50只，随机分为5组:正常组、模型组、治疗组 (参芍口服液高剂量组、参芍口服液低剂量组、辛伐他汀组)，每组各10只。正常组常规饲养，模型组和治疗组大鼠给予高脂饮食+维生素D3600000 IU/(kg·d)腹腔注射3 d。4周后，灌胃给药，参芍口服液高、低剂量组分别按8 mL/d、4 mL/d给药，辛伐他汀组按5 mg/(kg·d)给药，其余组给予生理盐水，给药8周。

1.4 取材方法 给药8周后处死，颈总动脉取血，ELISA法测定血清血脂指标;取完整主动脉 (从主动脉根部至髂总动脉分叉处)，一部分置4%多聚甲醛中固定，行免疫组化和HE染色;另一部分放入冻存管保存在－80℃冰箱中，用于免疫印迹检测，观察IL-8、VCAM-1和ICAM-1的表达。

1.5 免疫组织化学染色 按试剂盒说明进行，IL-8和ICAM-1蛋白阳性表达定位于胞浆。Image pro plus图像分析软件进行图像分析，每张切片随机选取6个视野 (各采集200×图像)，计算该样本的平均积分光密度值 (integral optical density，IOD)。1.6 免疫印迹 取大鼠胸主动脉组织100 mg匀浆，按试剂盒说明进行。以Image J软件对蛋白表达条带进行扫描及平均光密度值 (average optical density，OD)的定量分析。

2 结果

2.1 形态学观察 ①正常组动脉内膜、中膜和外膜结构完整，层次清晰。内膜为单层扁平状内皮细胞及其基质，内膜光滑完整，无增生，厚薄均匀，内皮细胞结构连续完整，层次清楚而光滑;中膜为长梭形的平滑肌细胞，排列整齐，细胞周围充满胶原和弹力纤维组织;外膜较薄，为疏松结缔组织，内含少量平滑肌细胞。②模型组动脉管壁三层结构不清晰，内膜粗糙，可见大面积增厚、隆起，内皮细胞有缺失，形成斑块，内有泡沫细胞，深部可见无细胞的不定型物质，其中含有胆固醇结晶、坏死组织和少量纤维素，在内膜下发现迁移的平滑肌细胞，其胞浆着色浅，似有脂质，中膜平滑肌细胞仍有增生，排列不规则，并向内膜迁移，病变演化为动脉粥样硬化早期脂质条纹。③参芍口服液低剂量组血管内膜粗糙，管壁增厚，中膜平滑肌增生，但病变程度较模型组轻。④参芍口服液高剂量组血管内膜局部内皮粗糙，有少量内皮细胞缺失，平滑肌细胞增生较少，病理改变明显好于模型组。⑤辛伐他汀组部分血管内皮粗糙，有少量内皮细胞缺失，中膜平滑肌细胞轻度增生，与参芍口服液高剂量组相似，病理改变明显好于模型组 (图1)。

图1 大鼠主动脉病理形态观察及IL-8和ICAM-1蛋白的表达Fig.1 Aortic pathological observation of rat and IL-8，ICAM-1 protein expression

2.2 TC、TG、LDL-C的变化 模型组TC、TG、 LDL-C显著高于正常组，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。给予参芍口服液和辛伐他汀治疗后，TC、TG、LDL-C表达明显下调，与模型组比较，差异均具有统计学意义 (均P＜0.05)。高、低剂量组之间比较，差异具有统计学意义 (P＜0.05)。见表1。

2.3 主动脉IL-8、VCAM-1、ICAM-1的表达 免疫组织化学结果显示 (图2):正常组无 IL-8、ICAM-1的表达。模型组血管内膜IL-8、ICAM-1表达较高。经参芍口服液及辛伐他汀治疗后，IL-8、ICAM-1表达较模型组下降，与模型组比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05)。高剂量组较低剂量组下降明显，具有统计学意义 (P＜0.05)。和辛伐他汀组比较无统计学差异 (P＞0.05)。

表1 参芍口服液对血脂的影响 (±s，n=10)Tab.1 Effect of Shenshao Oral Liquid on lipids(±s，n=10)

表1 参芍口服液对血脂的影响 (±s，n=10)Tab.1 Effect of Shenshao Oral Liquid on lipids(±s，n=10)

注:与正常组比较，#P＜0.05;与模型组比较，*P＜0.05;与低剂量组比较，△P＜0.05。

组 别TC/(mol·L －1)TG/(mol·L －1)LDL-C/(mol·L －1)正常组1.20±0.09 0.65±0.05 0.71±0.06模型组 18.07±1.02# 0.87±0.04# 10.56±0.53#低剂量组 12.77±0.86* 0.692±0.06* 7.46±0.26*高剂量组 9.40±0.49＊△ 0.38±0.04＊△ 6.83±0.12＊△辛伐他汀组 5.24±0.09* 0.41±0.03* 6.32±0.10*

图2 主动脉中IL-8、VCAM-1和ICAM-1蛋白的表达 (±s)Fig.2 Expressions of IL-8，VCAM-1 and ICAM-1 protein in aorta

免疫印迹结果显示 (图2，图3):与正常组比较，模型组的IL-8、VCAM-1和ICAM-1表达条带增强，差异具有统计学意义 (P＜0.05)。经参芍口服液及辛伐他汀治疗后，IL-8、VCAM-1和ICAM-1蛋白表达减弱，与模型组比较，差异均具有统计学意义 (均P＜0.05)。高剂量组较低剂量组下降明显，具有统计学意义 (P＜0.05)，和辛伐他汀组比较无统计学差异 (P＞0.05)。

3 讨论

冠状动脉粥样硬化是严重危害人类健康的常见疾病。中医冠状动脉粥样硬化无病名，根据其临床表现，多属于“胸痹”、“中风”、“真心痛”、“头痛”、“脱疽”等病证范畴［2］。中医认为，本病是脏腑功能失调，痰浊蕴聚、瘀热互结的结果，其发病机制可以概括为痰、瘀、虚、毒的本虚标实之症［3］。治疗上从整体观念出发，立足辨证施治，采用活血化瘀、化痰通络、益气补虚等法治疗本病，疗效肯定、无毒副作用［4］。

图3 主动脉内IL-8、ICAM-1蛋白的表达 (免疫印迹)Fig.3 Expression of IL-8，VCAM-1 and ICAM-1 protein(western blot)

课题组根据多年临床经验，认为本病虽病因众多，但最终归结为“瘀血阻滞，郁结于血脉”的主要病机，根据“久病必瘀”、“久病必虚”的中医理论，以“活血化瘀、益气通络”为法而立方参芍口服液。参芍口服液是由补阳还五汤加味而来，由丹参、黄芪、当归、川芎、赤芍、桃仁、红花、地龙、水蛭、清半夏组成。本方重用丹参为君药，其性苦，微寒，活血化瘀止痛;黄芪大补元气，使气旺则血行，当归活血和血，两药配合君药有活中兼养，祛瘀不伤血之妙，是为臣;川芎、赤芍、桃仁、红花助君增强活血化瘀之效;地龙、水蛭虫类药，长于行散走窜，通经活络;清半夏辛，温，化痰散结，临床病程迁延，防痰瘀互结加重病情;以上均为佐药。综观全方，诸药合用，融活血化瘀，益气通络为一体，以“疏其血，补其气，经通脉顺”，诸症自愈。现代药理研究，活血化瘀药物具有多种生物活性，能增加外周血流量，抑制炎症、保护血管内皮，抗血栓等作用［5］。

冠状动脉粥样硬化是心脑血管疾病的病理基础［6］，炎症反应在其发生、发展中起重要作用［7］。研究表明，过量IL-8的表达可引起单核细胞的趋化，促进单核细胞与内皮细胞间牢固黏附的因子以及平滑肌细胞增生和迁移，促进斑块形成［8-9］。ICAM-1、VCAM-1在动脉粥样硬化的炎症反应中发挥着重要作用，能够调节白细胞在血管内皮上的迁移和黏附，介导循环血液中外层部分单核细胞着边，黏附和迁移，一般很少表达于正常的冠状动脉血管［10-12］。

本研究结果显示，模型组血脂水平增高，IL-8、ICAM-1、VCAM-1高表达于损伤的内皮细胞和粥样硬化斑块内，给予参芍口服液治疗后，血脂水平降低，IL-8、ICAM-1、VCAM-1表达下降，效果同辛伐他汀治疗，提示参芍口服液通过改善血液脂质代谢，抑制炎症因子的表达，从而发挥抗炎作用，抑制动脉粥样硬化的形成。冠状动脉粥样硬化的形成，与脂质浸润、血小板黏附聚集、炎症反应、血管内皮受损、免疫功能失调、血管平滑肌增殖迁移、氧自由基损伤等多个作用环节有关［13］。本实验结果显示参芍口服液多环节因素延缓、减轻甚至逆转斑块的进展。从血脂调节，炎症反应方面探讨了中医药治疗冠状动脉粥样硬化多靶点、多环节的优势，为中医药治疗冠状动脉粥样硬化提供了新的思路和线索。

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