产益康栓对产后大鼠阴道组织MMP-1、TIMP-2表达的影响及其与盆底功能障碍的关系

瞿东晖，杨雪萍，董 敏

(1.甘肃省康复中心医院;2.甘肃中医学院，兰州 730000)

盆底功能障碍(pelvic floor dysfunction，PFD)又称盆底缺陷或盆底支持组织松弛，主要包括子宫脱垂等盆底器官脱垂(pelvic organ prolapse，POP)、大便失禁、压力性尿失禁(stress urinary incontience，SUI)和女性性功能障碍等。PFD可发生在任何年龄，15～64岁女性人群中占10% ～55%，患病率占女性人口的40%～60%以上，严重影响着女性的健康和生活质量，有预测30年后PFD的发病率将增加1倍［1］。近年来引起妇产科学界广泛的关注，预防其发病迫在眉睫。产后是PFD的高发期，正常分娩后，阴道腔扩大，阴道壁松弛及肌张力低，会阴部撕裂或切口缝合后硬结、水肿，盆底肌及筋膜因分娩过度扩张弹性减弱，且伴有肌纤维部分断裂等。盆底支持组织中的胶原蛋白以I型和Ⅲ型为主，基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1，MMP-1)可以降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原酶［2］，组织金属蛋白酶抑制物-2(tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2)是其抑制剂。因此本实验研究产益康对产后大鼠MMP-1、TIMP-2表达的影响，探讨其预防及治疗PFD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 已孕SPF级SD大鼠40只，由甘肃中医学院实验动物中心提供，许可证号SCXK(甘)2011-0001。所有妊娠大鼠均在SPF级实验室分笼饲养，直至自然分娩。

1.1.2 药品与试剂 产益康栓由甘肃省康复中心医院中药房制剂室制备成栓剂;生理盐水，批号:2011030801;碘伏，批号:2011062301;MMP-1兔抗鼠多克隆抗体，批号:BA1270，兔抗鼠TIMP-2多克隆抗体，批号:BA0576，即用型 SABC(SA1022-兔 IgG)试剂盒，DAB显色试剂盒(AR1022)均购自武汉博士德公司。

1.1.3 仪器 成都泰盟BI-2000图像分析系统(免疫组化分析软件)。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药 产后大鼠随机分为产益康栓组(产益康栓纳阴道0.4g·kg-1·d-1)、光照组(25 W白炽灯照射阴道5～10 min)、碘伏组、模型组，每组10只，碘伏组和模型组每日医用棉签分别浸泡碘伏和生理盐水涂擦阴道1次，连续8 d。

1.2.2 指标检测 基质金属蛋白酶-1，组织金属蛋白酶抑制物-2的检测。末次给药24 h后取阴道组织，切片常规脱蜡至水，3%H202处理10 min，蒸馏水洗3次，每次2 min，将切片置于枸橼酸缓冲液中，在温度120℃压力下，抗原修复2 min，冷却后PBS洗3次，每次2 min，加BSA封闭液，置于室温下20 min，甩去多余液滴，不洗。加配好的一抗室温下过夜，PBS洗3次，每次2 min。滴加二抗，PBS洗4次，每次5 min，DAB显色，苏木素复染，封固。镜下观察，细胞质或胞浆中有棕色颗粒为阳性表达。采用BI-2000医学图像分析系统，固定放大倍数(400倍)及光源强度。取8张免疫组织化学染色切片，每张切片随机选取5个视野。通过高分辨摄取图像信号，测定灰度值，表达强弱用平均灰度值表示。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件包进行分析。数据以表示，用单因素方差分析进行数据分析，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠阴道组织MMP-1、TIMP-2的表达(表1) 免疫组化定量分析示空白组较碘伏组、光照组MMP-1表达高，TIMP-2表达低，且有显著统计学意义(P＜0.01);实验组较碘伏组、光照组，MMP-l表达低，TIMP-2表达高，有显著统计学意义(P＜0.01)。

2.2 图像分析 MMP-1、TIMP-2表达阳性细胞均染成棕黄色，各组MMP-1、TIMP-2表达主要存在于阴道上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞的细胞浆和(或)部分细胞核(图1，图2)。空白组镜下见阴道组织内MMP-1呈棕黄色至棕褐色，弥漫状分布;实验组呈浅黄色，分布稀疏;碘伏组、光照组介于其中，并递减。TIMP-2的表达与MMP-1的表达正好相反。

表1 各组大鼠阴道组织MMP-1、TIMP-2的表达()

表1 各组大鼠阴道组织MMP-1、TIMP-2的表达()

注:与空白组比较，*P ＜0.01;与碘伏组比较，#P ＜0.01;与光照组比较，△P ＜0.01

图1 MMP-1免疫组化染色(H·E，×40)

图2 TIMP-2免疫组化染色(H·E，×40)

3 讨论

盆底结缔组织细胞外基质(exracellular matrix，ECM)主要成分是胶原蛋白和纤连蛋白等，胶原蛋白以I型和Ⅲ型为主。正常盆底结构的维持有赖于盆底结缔组织中的ECM，ECM的合成与降解保持着动态平衡，平衡破坏时就会产生以盆底结构改变为特征的盆底功能障碍，因此，细胞外基质的合成与降解的动态平衡对维持正常盆底解剖非常重要，ECM降解是PFD发生的基础［3］。MMPs的主要功能有:降解细胞外基质膜有效成分，调节细胞黏附，作用于细胞外组分或其他蛋白成分而启动潜在的生物功能，直接或间接参与胚胎发育、组织模型再塑及创伤修复等正常生理过程，其中MMP-1可以降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原酶，TIMP-2是其抑制剂。生理状况下，MMPs与基质金属蛋白酶特异性组织抑制物(TIMPs)之间保持动态平衡，保证了体内生理状况下细胞外基质的重建与稳定性［4］。而产后，阴道组织、盆底肌肉、神经、韧带、筋膜和血管的损伤，导致盆底胶原蛋白降解，ECM平衡破坏，结构改变，功能障碍。

产益康栓是在遵循中医传统理论的基础上精心组方而成，药用:党参、黄芪、当归、白术、川芎、桃仁、益母草、血竭、柴胡、升麻，具有活血化瘀，补气养血，升阳举陷的功效，临床疗效显著，本实验研究结果表明产益康栓对产后盆底功能障碍性疾病有预防及治疗作用，其作用机制与抑制阴道组织中MMP-1表达，促进TIMP-2表达有关，盆底功能障碍性疾病可归属于中医学“脱肛”、“小便不禁”、“便秘”、“魄门痛”等范畴，瘀血阻滞，气血两虚是其主要病机。MMP-1的活性减弱可能与产益康栓提高TIMP-2抑制作用增强，使其1∶1与MMP-1形成复合体，抑制MMP-1的活性及其酶原活化，从而造成 MMP-1活性降低，减少胶原降解有关［5］。方中党参、黄芪、白术补气健脾，当归补血、活血止痛，血竭活血化瘀、敛疮生肌，桃仁、川芎活血祛瘀、行气止痛，益母草利水消肿、清热解毒，柴胡、升麻升阳举陷。全方共奏活血化瘀，补气养血，升举阳气的功效。通过本实验探讨产益康栓的作用机制，能够丰富中医药预防及治疗盆底功能障碍的手段和方法。

［1］Xu Y Y，Yao Z W，Wang H Y，et al.The relationship between postparturn sexwal life quality and the way of delivery［J］.Obcter Gynecol，2003，38(4):219-222.

［2］Kengo Manase，Toshiaki Endo，Mitunobu Chida，et al.Coordinated elevation of membrane type 1-matrix metalloproteinase and matrix metalloproteinase-2 expression in rat uterus during postpartum involution［J］.Reprod Biol Endocrin，2006，4(1):32.

［3］Catterall J B，Cawston T E.Assays of matrix metalloproteinases(MMPs)and MMP inhibitors［J］.Methods Mol Biol，2003，225(3):353-364.

［4］Kassim S Y，Birkland T P，William C，Parks W C.Mouse models of MMP and TIMP function［J］.Methods Mol Biol，2010，622(1):31-52.

［5］Wang Y Z，Liang Z Q，Xu H C，et al.MMP-1 and TIMP-2 expression in pubocervical fascia from patients with stress urinary incontinence［J］.Acta academiae meaicinae milithris tertlae，2006，28(12):1304.