CD4+CD25+调节性T细胞与子宫内膜癌的相关性及其在免疫逃逸中的作用机制研究

赵琳蕾，王 婷，冯超蕙，付开霞，郭秋梅

(甘肃省康复中心医院，兰州 730000)

肿瘤作为机体的非我成分，免疫系统能产生抗肿瘤免疫应答，抑制肿瘤细胞增生和转移。大量研究提示恶性肿瘤患者的免疫系统在肿瘤局部和全身都处于耐受或缺陷状态，肿瘤在逃逸机体的免疫机制之后才得以进展。随着免疫学、分子生物学及基因生物工程技术的发展，以肿瘤免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗已成为继手术、化疗、放疗治疗肿瘤的新模式。CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)参与了肿瘤免疫耐受机制，这类细胞具有

免疫抑制及免疫无能等特性。随着肿瘤的免疫治疗成为肿瘤治疗的重要手段之一，Treg细胞在肿瘤治疗方面的应用也成为研究的热点。基于上述理论基础，本实验将探讨CD4+CD25+Treg细胞在子宫内膜癌局部和全身免疫中的作用机制，旨在为子宫内膜癌的预防及生物治疗方面提供新的切入点。

1 资料与方法

1.1 资料 选择2009年1月至2012年6月就诊于我科的子宫内膜癌患者26例，年龄28～75岁，平均(51.09±6.88)岁。所有病例均经病理学检查确诊，未行抗肿瘤治疗，且3个月内未使用过免疫增强或抑制剂。手术病理分期、组织分类均参照国际妇产科联盟2000年标准进行。子宫内膜样腺癌10例，腺鳞癌8例，透明细胞癌3例，鳞癌5例。FIGO分期:Ⅰ期+Ⅱ期10例，Ⅲ期+IV期16例。另选择经年龄相匹配的25位健康志愿者作为正常对照组，年龄30 ～81岁，平均(54.25±9.20)岁。

1.2 方法

1.2.1 标本处理

1.2.1.1 外周血单个核细胞(PBMCs)制备 采集研究对象术前、健康志愿者同一时间外周静脉血2 ml，EDTA抗凝;15 ml离心管内加入适量淋巴细胞分离液，将EDTA抗凝血用PBS等倍稀释后，轻缓铺在分离液面上;离心1200 rpm×10min;吸取界面细胞，冰PBS洗涤2次后重悬细胞备用。

1.2.1.2 肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)和非肿瘤浸润性淋巴细胞(NILs)制备 取手术切除的新鲜肿瘤组织、洗净，在无菌条件下去除坏死组织及结缔组织，剔除脂肪组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块;在碎组织块中加入终浓度0.1%的胶原酶，置4℃条件下消化24 h，细胞悬液经100目钢丝或尼龙网过滤，过滤后的细胞悬液以50 rpm离心10 min，弃上清，加适量Hanks液稀释，在试管中依次加入100%、75%Ficoll-Hypaque分离液及细胞悬液，进行不连续密度梯度，2000 rpm离心10 min，收集75%与100%之间界面上的细胞悬液备用。取距离肿瘤5 cm的组织作为对照，制备非肿瘤浸润性淋巴细胞，方法同上。

1.2.2 流式细胞仪检测 将PBMCs/TILs/NILs加样至流式检测管内，每管至少2×105个细胞，加入CD4-PE、CD25-FITC单抗和 CCR4-PE，4℃孵育 20 min，加入PBS 2 ml洗涤，并以200×g离心沉淀5 min，吸去上清，混匀细胞后加入0.5 ml l%多聚甲醛，上流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司产品)检测或置2～8℃冰箱中备用。

1.2.3 ELISA法测定IL-10和TGF-β水平 取100 μl标准品，各组血清加入相应试剂板的微孔中，再加入生物素化抗体工作液100 μl/孔，用封板胶纸封住反应孔，室温共同孵育120 min，自动洗板机洗涤4次，加入酶结合物工作液100 μl/孔，封住板孔，室温孵育30 min，洗板4次。每孔中加入底物各50 μl，避光 37℃30 min，见显色后加终止液 50 μl。用美国ELX800全自动定量绘图酶标仪在450 nm处测定OD值，计算样品含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差()表示，非正态分布资料采用Kruskal-Wallis H检验;两组比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD4+CD25+Treg检测结果 肿瘤组织CD4+CD25+Treg占 CD4+T细胞比例为(23.91±3.72)%，明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P＜0.05)。子宫内膜癌患者外周血Treg水平高于癌旁组织及对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。癌旁组织和对照组的Treg水平差异无统计学意义(P＞0.05)。肿瘤组织 CCR4阳性细胞占CD4+T细胞比例为(96.37±11.46)%，明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P＜0.05)。子宫内膜癌患者外周血CCR4阳性细胞高于癌旁组织及对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。癌旁组织和对照组的CCR4阳性细胞水平差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

表1 CD4+CD25+Treg及CCR4表达水平检测结果()

表1 CD4+CD25+Treg及CCR4表达水平检测结果()

注:与对照组、肿瘤患者外周血、癌旁组织相比较，*P＜0.05

2.2 CD4+CD25+Treg与子宫内膜癌临床及病理特征间的关系 选择子宫内膜癌患者外周血单个核细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞中CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞的百分比，结合临床及病理特征参数作分层分析。结果显示:FIGO分期I-II期患者的外周血单核细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞中，CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞的百分比分别为(6.35±0.92)%和(18.33±2.06)%，均显著低于 III-IV 期患者的(12.16 ±2.61)%和(28.93 ±3.51)%，差异均有统计学意义(P＜0.05);淋巴结转移组外周血单核细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞中，CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞的百分比分别为(12.73±2.04)%和(32.99 ±1.47)%，均显著高于无转移组的(5.77±1.72)%和(14.06 ±3.92)%，差异均有统计学意义(P＜0.05);在年龄、病理类型、组织学分级等之间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 CD4+CD25+Treg与子宫内膜癌临床及病理特征间的关系(n=26，)

表2 CD4+CD25+Treg与子宫内膜癌临床及病理特征间的关系(n=26，)

2.3 子宫内膜癌患者血清IL-10和TGF-β水平检测 子宫内膜癌患者的IL-10和TGF-β水平分别为(128.93 ±10.52)pg/ml和(69.35 ±7.36)ng/L，显著高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 两组血清IL-10和TGF-β水平检测结果(n=26，)

表3 两组血清IL-10和TGF-β水平检测结果(n=26，)

3 讨论

肿瘤的发生、发展与机体的免疫状态有关，机体的细胞免疫功能受到抑制是肿瘤发生、发展、转移和复发的重要原因。Treg细胞在肿瘤细胞逃逸机体的免疫过程中通过抑制激活的T细胞功能而在维持自身免疫耐受性中发挥着重要作用［1］。子宫内膜癌(endometrial carcinoma，EC)是妇科生殖系统三大恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤20% ～30%，发病率近年呈上升趋势，全球每年约有超过10万余名妇女患子宫内膜癌，并有4万患者死于该疾病［1］，Ⅳ期患者 5 年生存率仅为 5% ～ 23%［2］。因此子宫内膜癌是目前严重威胁着女性健康的恶性肿瘤之一。对子宫内膜癌的治疗提倡精确的手术分期，以手术为主、放疗、化疗为辅的综合治疗。随着免疫学、分子生物学及基因生物工程技术的发展，以肿瘤免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗已成为继手术、化疗、放疗治疗肿瘤的新模式。

近几年，越来越多的证据表明［3］，在肿瘤形成过程中除了细胞的癌基因和抑癌基因活化和失活，机体免疫监视系统的逃逸也是不容忽视的重要因素，肿瘤细胞可以通过某些途径逃逸或者抑制机体免疫反应而确保其自身的发生发展。调节性T细胞是一群具有免疫抑制功能的负调控细胞，具有:①免疫无能性:表现在对高浓度白细胞介素-2的单独刺激，固相包被或可溶性抗 CD3单抗，以及抗CD3单抗、抗CD28单抗的联合作用呈无应答状态，也不分泌IL-2。当经T细胞受体(TCR)介导信号刺激并有高浓度外源 IL-2存在的情况下，CD4+CD25+Treg可活化并增殖，但其增殖程度较CD4+CD25-T细胞弱得多。② 免疫抑制性:表现在经TCR介导的信号刺激活化以后能够抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖。经TCR介导的信号刺激可以是用抗CD3单抗产生的多克隆的刺激，也可以是抗原特异性刺激，一旦CD4+CD25+Treg细胞被活化，其抑制效应呈现为非抗原特异性，即对CD4+和CD8+T细胞均有抑制作用［4］。这一现象可以通过Treg的细胞因子作用模式得以印证:Treg合成分泌抑制性细胞因子反应系非特异性的，故活化Treg对效应性T细胞的作用也是抗原非特异性的。CD4+CD25+Treg能抑制T细胞对外源和自体抗原的免疫反应，因此在维持对自身成分免疫耐受的同时，也可能阻止了机体对自体同源肿瘤细胞的免疫。因此，CD4+CD25+Treg细胞影响着免疫系统对肿瘤抗原的应答，从而影响着肿瘤的发生和发展。已有研究证实［5］，Treg细胞与许多肿瘤的发生、发展及预后均有密切关系。其中，CD4+CD25+Treg细胞发挥抑制抗肿瘤免疫作用主要发生在两个部位:一是在肿瘤细胞引流淋巴结内，这些大量增殖的CD4+CD25+Treg细胞抑制了同一淋巴结中效应T细胞的增殖;二是在肿瘤组织内，增加的CD4+CD25+Treg细胞抑制肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)中效应T细胞杀伤肿瘤细胞的功能。随着肿瘤的免疫治疗成为肿瘤治疗的重要手段之一，Treg细胞在肿瘤治疗方面的应用也成为研究的热点。

1995年，Sakaguchi研究小组首先报道和定义了具有免疫抑制功能的CD4+CD25+调节性T细胞亚群。此后，从人体外周血中也分离鉴定出表型和功能类似的T细胞亚群，它是一种免疫抑制性细胞，能够分泌白细胞介素4(IL-4)、IL-10和转化生长因子TGF-β等，正常人外周血中，CD4+CD25+Treg较少，占总CD4+T细胞的5% ～10%，具有免疫无能性和免疫抑制性两大特征，被称为＂职业/专职性抑制细胞＂。进一步研究发现，除起源于胸腺的自然发生调节性T细胞(CD4+CD25+naturally occurring regulatory T cells，nTregs)外，还存在外周发生的获得或诱导性调节性T细胞(adaptive or induced regulatory Tcells，aTregs or iTregs)，但两者从表型特征和功能特性难以区分。此后人们对CD4+CD25+Treg细胞的研究予以了极大的关注。Treg分子作用机制逐渐被阐明，其调节功能在机体免疫稳态维持、移植耐受、过敏反应、微生物感染及肿瘤免疫等方面均得到了证实。CD4+CD25+Treg能抑制T细胞对外源和自体抗原的免疫反应，因此在维持对自身成分免疫耐受的同时，也可能阻止了机体对自体同源肿瘤细胞的免疫。因此，CD4+CD25+Treg细胞影响着免疫系统对肿瘤抗原的应答，从而影响着肿瘤的发生和发展。Mao等［6］研究发现在恶性肿瘤患者中CD4+CD25+FOXP3+Treg含量明显增加，Patel等研究发现，CD4+的T细胞在宫颈上皮内瘤样变中发挥主导作用，CD8+的T细胞在宫颈癌中起主要作用，CD4+CD25+的Treg在宫颈癌中明显增加，Barnett等［7］的研究证实，卵巢癌患者Treg细胞数量的增加与卵巢癌的进展程度呈正相关。Graziano等［8］报道胃癌患者肿瘤内FOXP3+Tregs水平的升高通常提示预后较差，5年生存率低，手术根治切除后Tregs明显下降，但手术后再次复发者Tregs数量也会随之升高。Kobayashai等［9］对323例癌的病变、早晚期肝癌，39例肝内胆管癌和39例转移性肝癌结节进行免疫组化分析，发现肝癌组织中Tregs数量明显高于正常肝组织，Tregs在原发肝癌组织中的数量明显高于转移性肝癌结节中的数量，并且提出肝癌组织中浸润性Tregs密度是肝癌的独立性预后因素。Generali等［10］报道Tregs与乳腺癌患者预后问的关系，显示Tregs在导管原位癌和浸润性乳腺癌中的量高于正常乳腺组织，在浸润性乳腺癌中又高于导管原位癌，而Tregs水平增高与导管原位癌患者的高复发风险和浸润癌患者之疾病进展生存期和总生存率缩短均有关。上述研究结果证实Tregs在肿瘤中的水平增高是一种普遍存在的现象，也意味着Tregs与肿瘤生长和患者预后有密切关系。目前认为，这可能与Tregs参与肿瘤免疫逃逸密切相关，机制如下:① 细胞毒作用:穿孔素-颗粒酶通路一直被认为是CD8+T细胞和NK细胞杀伤变异的宿主细胞的途径，其机制是细胞毒性淋巴细胞通过穿孔素将颗粒酶A和B输送入靶细胞，使其作用于细胞内重要底物，从而诱导靶细胞的凋亡。但是近年来研究却发现Tregs也能通过穿孔素-颗粒酶介导的细胞毒作用途径发挥免疫抑制效应。Grossman等［11］最先发现使用抗CD3和CD46单克隆抗体激活的人Tregs细胞能够表达颗粒酶A和(或)B，并且能杀伤自身免疫性细胞，这一由Tregs介导的杀伤效应是穿孔素依赖性的而非FasL依赖性途径。与此相同，Gondek等［12］报道抗CD3单克隆抗体刺激产生的鼠源性Tregs能够表达颗粒酶B，并且通过细胞接触性的颗粒酶B依赖性机制，发挥抑制CD4+CD25+T细胞增殖的作用。另外，Cao等［13］在体内试验中发现，存在于肿瘤微环境中的细胞因子可以诱导肿瘤相关的Tregs高表达颗粒酶B，而颗粒酶B缺乏小鼠对移植瘤的排斥作用增强，通过对肿瘤微环境中所有淋巴细胞亚型进行分析发现Tregs可利用颗粒酶B抑制NK细胞和CD8+T细胞活性，并且这种抑制作用是依赖于穿孔素的作用完成的;②分泌抑制性细胞因子:IL-10、TGF-β免疫抑制作用已在多种免疫疾病模型中得到证实。Loser等［14］发现在射线诱导的小鼠皮肤癌形成过程中，IL-10在CD25+CD4+Tregs介导的抗肿瘤免疫反应抑制方面具有重要作用。Chen等［15］则通过建立抗原特异性小鼠结肠癌模型，发现CD25+CD4+Tregs可以通过特异性的抑制CD8+细胞的细胞毒作用，抑制CD8+T细胞介导的肿瘤清除效应，而在这一抑制作用过程中，TGF-β发挥了关键作用，因为 TGF-β受体阴性表达的CD8+T细胞能够对Tregs介导的免疫抑制产生明显耐受，并且这些CD8+T细胞仍能发挥其细胞毒作用。另外，Ghiringhelli等［16］观察发现，在胃肠道间质瘤患者中，自然杀伤(natural killer，NK)细胞活性与Tregs扩增水平呈负相关。进一步的研究则表明，人体Tregs是通过膜结合性TGF-β直接抑制NK细胞效应因子功能并且下调NK细胞表面的NKG2D受体，从而抑制NK细胞活性。以上研究结果均显示，Tregs细胞可以通过分泌 TGF-β抑制CD8+T细胞及NK细胞的抗肿瘤效应。近来也有研究表明，由头颈鳞癌患者体内分离出来的Tregs能够通过IL-10和TGF-β依赖性机制抑制机体的抗肿瘤效应，更进一步证明了Tregs可通过分泌IL-10、TGF-β等免疫抑制性细胞因子发挥免疫抑制作用;③通过与效应T细胞竞争结合IL-2或直接作用，抑制其增殖并诱导其免疫无能;④ 诱导APC向免疫耐受方向发展;⑤抑制免疫效应细胞向肿瘤局部微环境聚集。

肿瘤微环境在肿瘤发生发展中的重要作用已被证实，本研究结果提示，Treg细胞在肿瘤局部的水平明显高于外周血，此种肿瘤微环境中的调节性T细胞被证实包含胸腺来源的自然发生调节性T细胞和局部诱导的调节性T细胞，可能系通过募集机制富集于肿瘤局部。Curiel等［17］证实，肿瘤细胞和微环境内巨噬细胞分泌 CCL22，趋化表达 CCR4的CD4+CD25+调节性T细胞优先向腹水和瘤体内聚集，首次揭示人体调节性T细胞可通过趋化因子-趋化因子受体轴向肿瘤内特异性募集和积聚。本课题检测CCR4+细胞表达水平后发现，其在子宫内膜癌患者肿瘤组织的表达明显高于外周血，这与Treg细胞水平表达一致，提示，CCL22-CCR4轴在Treg细胞向瘤体内募集中发挥着重要作用。

Treg细胞对效应性T细胞的抑制作用可以通过细胞接触机制和细胞因子分泌方式实现。研究表明［18］，IL-10及 TGF-β 在 Treg细胞的免疫抑制效应中起主要作用。最近的研究发现，Treg在体内可并不影响自身反应性细胞的增殖，而是将病理性自身免疫性Th1细胞转化成了分泌高水平IL-10的T细胞，这些细胞可以以IL-10依赖的方式抑制实验性变态反应性脑脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的发作。IL-10不仅在以上提及的Th1细胞介导的自身免疫性疾病中起到重要的免疫调控作用，也在抑制Th2细胞介导的Ⅰ型变态反应等疾病中发挥了重要作用。事实上，当前变应原特异性免疫治疗(amplified immune therapy，AIT)的关键目标之一就在于诱导出分泌IL-10的Treg。IL-10可通过抑制树突状细胞(dendritic cell，DC)和巨噬细胞产生炎性细胞因子，以及抑制MHCⅡ和共刺激因子的表达等机制来抑制Th1效应;通过抑制Th2细胞因子的产生、IgE的合成、肥大细胞和嗜酸性粒细胞的生存与活化等机制来抑制Th2效应。另外，IL-10还可抑制巨噬细胞杀灭胞内病原体及抑制单核细胞前体发育为DC。TGF-β的作用机制与IL-10大致相似，主要包括抑制B细胞、Th细胞及CTL的增殖、分化与功能等。另外，TGF-β亦可能在将CD4+CD25-T细胞诱导成CD4+CD25+Treg的过程中起到重要作用。近来有研究发现，除了在胸腺外，CD4+CD25+Treg也可由外周循环中的CD4+CD25-T细胞经 TGF-β诱导而成，且这种TGF-β诱导形成的Treg(Ti-Treg)能显著抑制Th1细胞介导的结肠炎。本研究证实，子宫内膜癌患者体内IL-10、TGF-β水平明显高于对照组，提示Treg通过分泌IL-10和TGF-β等抑制性细胞因子及细胞接触依赖的抑制途径，抑制免疫效应细胞，进一步促进肿瘤细胞的免疫逃逸。

总之，子宫内膜癌患者体内CD4+CD25+Treg细胞明显上调，且在肿瘤组织局部表现更为明显，这可能参与了肿瘤的免疫逃逸，促进肿瘤生长和演进，机制可能与IL-10、TGF-β及CCR4表达上调有关。但本研究仍存在样本量小的局限性，尚需开展更大样本、多中心研究来证实本研究结果。

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