液基薄层细胞学联合免疫细胞化学检测卵巢癌腹水的应用研究

王玥元，周庆云，石清芳，赵 洁

(甘肃省妇幼保健院病理科，兰州 730050)

卵巢癌是妇女最常见的生殖器恶性肿瘤之一，主要通过脱落的癌细胞腹腔种植转移，也是妇科恶性肿瘤中导致死亡的主要原因。腹水是卵巢癌的常见体征，原发性卵巢癌和转移性卵巢癌均可以合并腹水，约有55%～65%的原发性卵巢癌患者合并有大量腹水，是最常见的合并腹水的肿瘤［1-2］。随着消化道肿瘤的发病率上升，转移性卵巢癌的比例也有所增加，由于治疗方法不同，因此鉴别诊断至关重要。目前，腹水良、恶性的诊断仅依靠细胞形态学诊断，由于受到标本性状、制片水平、阅片经验的限制，尤其是反应性间皮细胞呈现非典型性时与腺癌细胞在形态上存在交叉，鉴别时会很困难。本研究应用液基薄层细胞学(thinprep cytologic test，TCT)与免疫细胞化学(immunocytochemistry，ICC)技术相结合的方法，利用TCT制片代替传统细胞涂片并联合ICC鉴别良、恶性腹水，并可进一步鉴别恶性腹水为原发还是转移性卵巢癌所产生，为临床治疗提供可靠依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象 收集我院2010年4月至2012年6月临床送检的新鲜卵巢肿瘤患者腹水，应用TCT和普通涂片检测恶性肿瘤(癌)细胞;对病理组织学诊断为卵巢癌的56例，45例原发性卵巢上皮性癌;11例为转移性腺癌，其中7例来源于胃，4例来源于肠。腹水制备TCT薄片并做ICC，CKP、CKL、CEA、CR一组抗体用来鉴别腹水的良、恶性，CK7、CK8、CEA、CK20这组抗体用来鉴别腹水中的腺癌细胞是卵巢原发的还是消化道转移来的，ICC试剂均购自福州迈新试剂公司。

1.2 检测方法

1.2.1 TCT技术制备薄片 取 50 ml腹水2管，2500 r/min离心10 min后，其中一管取细胞层制备普片2张，潮干置于95%的乙醇中固定15 min，H·E染色、封片;另一管弃上清，加入细胞处理液30 ml，充分振荡、混匀，2500 r/min离心10 min后弃上清，沉渣全部涮入细胞保存液小瓶中，静置15 min后，制备液基薄片数张备做H·E及ICC(ICC片使用专用免疫组化玻片购自福州迈新试剂公司)，潮干置于95%乙醇中固定15 min，取一张行H·E染色、封片。

1.2.2 免疫细胞化学方法 采用即用型快捷免疫组化两步法染色，DAB显色，用已知阳性腹水做阳性对照，用PBS液代替一抗做阴性对照。

1.3 结果判定 阳性细胞必须具备细胞结构清晰、阳性颗粒定位好、着色明显高于背景的特点，阳性显微镜下表现为胞膜、胞浆或胞核的棕黑色、棕褐色颗粒着色。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件，免疫细胞化学结果用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标本质量评估 56例卵巢癌腹水标本，采用常规涂片后，其中36例血液成分多导致涂片厚，20例炎性渗出物多，背景不干净，判读困难，手工涂片厚薄不均匀，影响诊断;TCT薄片制作中经特殊细胞处理液处理后，红细胞及炎性细胞减少，黏液大部分被祛除，可供诊断的细胞量提取较多，将细胞均匀置于直径2 cm的范围内，细胞分布均匀、结构清晰、核染色质清晰可辨、背景清晰，影响诊断因素降低，诊断质量提高。

2.1 TCT结果判读 H·E染色光镜下肿瘤细胞排列呈腺样、乳头状、团状或散在分布，核轻至中度异型，核浆比增加，染色质粗，核膜不规则，核仁明显。本组56例中25例诊断为恶性肿瘤(腺癌)细胞，21例诊断为可疑腺癌细胞，10例诊断为间皮细胞。

2.2 普通涂片结果判读 H·E染色光镜下16例可清楚识别癌细胞，25例由于涂片厚薄不均、可供识别的细胞数量、背景不干净影响而判读为非典型腺细胞、可疑恶性肿瘤(腺癌)细胞，15例诊断为间皮细胞。

2.3 免疫细胞化学结果 56例卵巢癌腹水经TCT诊断为腺癌细胞25例、可疑腺癌细胞21例、间皮细胞10例。其免疫细胞化学结果如表1，阴性对照中4种抗体均不表达，CR在间皮细胞核阳性表达。

表1 免疫细胞化学(ICC)结果(n)

TCT诊断为可疑腺癌的21例中12例ICC为阳性结果，应归属于腺癌，即TCT诊断为腺癌细胞和可疑癌细胞的46例卵巢癌腹水经ICC标记应有36例为腺癌细胞，明显高于单纯的TCT诊断的腺癌25例(P ＜0.05)。

56例卵巢癌经病理组织学检查45例为原发性卵巢上皮性癌，11例为转移性腺癌(其中7例来源于胃，4例来源于肠)，ICC结果见表2。

表2 56例卵巢癌经病理组织学检查阳性结果［n(%)］

CK7在原发性卵巢癌中阳性率为94.2%(图1A)，转移性卵巢癌中原发灶在胃的7例中5例为阳性，阳性率为71.4%。CK8在原发性卵巢癌中阳性率为86.7%，转移性卵巢癌为72.7%，无统计学意义。原发性卵巢癌中2例表达CEA阳性，阳性率仅为4.4%。转移性卵巢癌中原发灶在胃的7例不表达CEA，而由肠转移至卵巢的4例呈阳性，阳性率为100%。CK20在原发性卵巢癌中有4例表达，阳性率为9.8%，转移性卵巢癌中原发灶在胃的不表达，原发灶在肠的全部表达，与CEA表达基本一致，经统计学检验，CK7、CEA、CK20三种抗体在原发性卵巢癌与卵巢转移癌中阳性率的差异均有显著性(P ＜0.05，表2)。

图1 CK7、CKP和CR在卵巢癌中的表达

3 讨论

卵巢癌腹水的常规细胞学检查仍然是目前临床常用的诊断方法之一，传统的巴氏涂片法在腹水的肿瘤细胞筛查上应用已超过半个世纪，但容易出现漏诊或误诊，主要原因是其标本的制作往往受到腹水的新鲜程度、细胞数量、退变程度、血细胞含量或炎细胞干扰、黏液过多、涂片厚薄，固定状态等多方面因素的影响，造成涂片质量差，导致较高比例的假阴性率、假阳性率出现［3］。液基细胞学以其固定及时、细胞形态保存完好、细胞数量适中、涂片薄、背景干净等优点，正逐步扩展到细胞学的各个领域［4］。本文选用TCT技术对标本采集、制片技术比传统涂片具有以下优点［5］:①通过离心，细胞均匀涂布形成一个直径2 cm的细胞薄层，结构清晰，背景干净，改变手工涂片细胞拥挤、重叠，形态特点不易观察的缺点;②避免了细胞过度干燥造成的假象;③为免疫细胞化学提供高质量的薄片，防止掉片现象发生。本组56例腹水病例中，采用 TCT技术制备液基薄片，细胞分布均匀、细胞核结构清晰、核染色质清晰可辨、背景清晰，克服了传统涂片由于标本血液成分多、黏液多而影响制片质量问题，降低了阅片难度，提高了腹水细胞学诊断率。

近年来，免疫组化在肿瘤病理学中的应用日益增多，特别是细胞学诊断，称为免疫细胞化学，我科室在日常工作中已经成熟使用此方法检测胸水、腹水、术中腹腔冲洗液，并总结出好的制片方法，获得了良好的诊断效果(图1B)。以往采取常规涂片细胞学方法检查胸、腹水时，文献报道有高达12%的病例会遇到间皮细胞与癌细胞难以鉴别的状况［6］。正常成熟的间皮细胞常常成片存在，细胞间界限清晰，细胞圆形或卵圆形，核多居中，染色质均匀细致、核仁不易见到。但在慢性炎症、放疗、化疗及肿瘤的刺激下间皮细胞呈现一定的异型性，核略增大，染色质稍浓，可呈假腺腔样、梅花状或桑葚状排列［7］。仅凭光镜鉴别间皮细胞及腺癌细胞十分困难。此时，利用免疫细胞化学可辅助细胞学鉴别诊断胸、腹水的性质。本组实验中56例卵巢癌腹水单纯依靠形态学诊断的21例可疑癌细胞中有12例经ICC标记后，归属于腺癌细胞。此结果提示，在单纯依靠形态观察不能明确诊断时，使用一组单克隆抗体ICC对鉴别腺癌细胞与反应性间皮细胞是行之有效的，是一项具有重要价值的辅助手段。本结果中CKP在腺癌细胞中的阳性率达100%，CKL在腺癌细胞中阳性率达96%，CEA在腺癌细胞中阳性率达100%，前两者在间皮细胞中均不表达，CEA在间皮细胞中仅1例表达(+)。文献报道CR对间皮细胞的敏感性为 80% ～100%，假阳性率为 0～39%［8-11］，CR在腺癌细胞中表达胞浆阳性，而在间皮细胞中呈胞核阳性(图1C)，本文CR在腺癌中无表达，在间皮细胞中核表达，与文献报道一致。本组实验结果显示，CKP、CKL、CEA及CR联合应用是鉴别腺癌细胞和间皮细胞非常有价值，作为一组正反互补抗体，可相互取长补短，从正反两个方面同时证实癌细胞的存在，在日常工作中可依照腹水H·E片初筛情况酌情增加其它抗体，多种抗体联合应用可提高诊断的准确率。此方法也是判断卵巢癌患者预后的一个重要指标［12］;此外，对于阳性患者还可采取术后早期腹腔化疗，这对提高卵巢癌患者的生存率及治愈率具有重要的意义。

本组实验中CK7在原发性卵巢癌中阳性率为94.2%，转移性卵巢癌中原发灶在胃的7例中5例为阳性，阳性率为 71.4%，Ueda等［13］曾报道 61例原发卵巢癌均呈阳性，而5例由结肠来源的转移性卵巢癌CK7为阴性，4例由胃来源的卵巢转移性癌CK73例(+)，1例(++)。国内也有报道表明原发灶在肠的卵巢转移性癌一般CK7为阴性。所以，CK7阳性则有两种可能:一种可能是原发性卵巢癌;另一种可能是由胃而来的卵巢转移性癌，本组实验结果与文献基本一致。原发性卵巢癌中2例表达CEA阳性，阳性率仅为4.4%。转移性卵巢癌中原发灶在胃的7例不表达CEA，而由肠转移至卵巢的4例呈阳性，阳性率为100%。CK20在原发性卵巢癌中有4例表达，阳性率为9.8%，转移性卵巢癌中原发灶在胃的不表达，原发灶在肠的全部表达，与CEA表达基本一致，经统计学检验，CK7、CEA、CK20三种抗体在原发性卵巢癌与卵巢转移癌中阳性率的差异均有显著性。综上所述，腹水中测定CK7、CEA、CK20有助于区分腹水中肿瘤细胞的来源，结合病理组织学诊断，对晚期卵巢癌诊断治疗有实用价值。

总之，卵巢癌腹水细胞病理学诊断为临床的明确病因及进一步治疗提供了很重要的依据，液基细胞学与免疫细胞化学技术相结合在疑难腹水鉴别诊断中起了关键作用，多种抗体的联合应用可用于鉴别诊断腺癌细胞及间皮细胞，并可进一步辅助判断区分肿瘤细胞是卵巢原发还是转移而来，值得推广应用。

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