生存素反义寡核苷酸对人胃癌细胞移植瘤作用及原理探讨

王超群 孔庆兖

生存素（Survivin）是细胞内凋亡抑制蛋白家族成员，能够促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。研究表明，生存素在胃癌等肿瘤细胞中高表达，应用反义策略阻断生存素表达在体外可明显抑制胃癌细胞的生长[1]。本文研究探讨生存素反义寡核苷酸对人胃癌裸鼠移植瘤的作用，并探讨其与转录激活因子STAT-3的关系。

1 资料与方法

1.1 主要试剂 人胃癌细胞系HS2746T（武汉大学培养物保存中心）；兔抗人STAT-3单克隆抗体（美国CST公司）；兔抗人Survivin多克隆抗体（福州迈新公司）；PV-9000通用型二步法免疫组化检测试剂盒和DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司）。生存素正、反义寡核苷酸由上海博亚生物工程有限公司合成与纯化。

1.2 实验动物 BALB/C nu/nu裸小鼠30只，雌雄各半，4～6周龄，体重20～22g，由同济医学院实验动物中心提供。

1.3 人胃癌细胞的培养与裸鼠胃癌模型的建立[2]将 人胃癌细胞系HS2746T置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液常规培养。

取对数生长期的人胃癌细胞HS2746T，稀释为浓度为315×105/mL的细胞悬液，取0.2mL细胞悬液接种于裸鼠的背部左后肢处，以皮下结节直径超过0.5cm作为成瘤标准，接种后观察注射点无破溃红肿，2周左右成瘤，成瘤率为100%。

1.4 实验分组与处理 将30只成瘤裸鼠按随机数字表法分成5组，即空白对照组、SODN对照组和100、200、400nmol/L 3种浓度的ASODN组。各组于接种后15d开始第一次注射，并于第一次注射后2d、4d、8d、12d、16d、20d体内多点注射相应试剂0.2mL。

每次注射前用游标卡尺测量移植瘤体积，并记录裸鼠体重。20d后断颈处死裸鼠，取肿瘤称重并计算抑瘤率和肿瘤缩小率。肿瘤体积计算公式为：V(mm3)=[π×瘤体最长径(a)×最短径(b)2]/6；抑瘤率计算公式为：（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%；肿瘤缩小率计算公式为：（注射前体积-注射后体积）/治疗前体积×100%。

1.5 免疫组化二步法检测STAT-3蛋白的表达 取所有裸鼠皮下移植瘤，经10%福尔马林固定后常规石蜡包埋，制成4μm厚的切片，免疫组化二步法操作步骤参照PV-9000通用型二步法免疫组化检测试剂盒和DAB显色试剂盒的产品说明书进行，并以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件处理数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生存素反义寡核苷酸对人胃癌细胞移植瘤的作用 所有裸鼠在接种人胃癌细胞悬液后均存活并形成肿瘤，接种点无破溃红肿，成瘤时间为（13.0±2）d，接种15d后移植瘤为（72.1±8.5）mm3，比较各组平均数，均无统计学差异，具有可比性。在第一次注射后2d、4d、8d、12d、16d、20d，空白对照组及SODN对照组在肿瘤体积、抑瘤率及肿瘤缩小率等方面的差异均无统计学意义（P＞0.05）。100、200、400nmol/L 3种浓度的ASODN组在第一次注射后4d～8d，肿瘤体积明显小于空白对照组及SODN对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），肿瘤缩小率明显高于空白对照组及SODN对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。比较3个不同浓度的ASODN组发现，随着给药浓度和时间的增加，裸鼠移植瘤的体积减小而肿瘤缩小率增大，呈时间和剂量依赖性。裸鼠处死后测定抑瘤率，3个不同浓度的ASODN组明显大于空白对照组及SODN对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），且400nmol/L ASODN组的抑瘤率最大达到84%。不同处理组对人胃癌细胞移植瘤的抑制作用见表1。

2.2 生存素反义寡核苷酸与转录激活因子STAT-3的关系

空白对照组及SODN对照组移植瘤中的STAT-3蛋白表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白对照组比较，第一次注射后4～8d，3个不同浓度的ASODN组移植瘤中的STAT-3蛋白表达水平明显提高（P＜0.05），且呈浓度和时间依赖性。

表1 不同处理组对人胃癌细胞移植瘤的抑制作用

3 讨论

生存素在机体细胞中的表达具有非常严格的细胞周期性，尤其在G2/M期可以特异性的表达，此外生存素的表达具有高度特异性，可以在大多数肿瘤组织和胚胎发育组织中表达，但是在正常人的终末分化组织中是不表达的。应用反义策略阻断生存素表达抑制癌细胞的生长是治疗癌症的新思路。

生存素与胃癌的形成和发展关系密切，是早期发现胃癌的良好标志物，也是判断预后的较佳指标。本研究成功建立了人胃癌细胞皮下移植瘤模型，研究结果表明，空白对照组及SODN对照组对皮下移植瘤无明显抑制作用，而3个不同浓度的ASODN组对皮下移植瘤均具有一定的抑制作用，且呈时间和剂量依赖性，提示生成素ASODN能够有效抑制移植瘤的生长。这与国外报道的生存素具有抑制肿瘤生长的报道是一致的，此外，本研究还探讨了生成素ASODN与转录激活因子STAT-3的关系，结果表明，随着生成素ASODN浓度的增加，移植瘤中的STAT-3蛋白表达水平明显提高，呈正相关。有文献报道，生成素可能是STAT-3信号通路的一个下游靶基因[3]。通过注射生成素ASODN降低了生成素表达，通过负反馈调节，从而增加转录激活因子STAT-3的表达。

[1]付广,王国斌,卢晓明,等.生存素反义寡核苷酸对胃癌细胞的抑制作用[J].中华实验外科杂志,2005,22(9)：1084-1086.

[2]付广,王国斌,卢晓明,等.脂质体生存素反义寡核苷酸抑制胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用[J].中华实验外科杂志,2004,42(22)：1367-1371.

[3]张建国,赵晶,李远航,等.STAT3、p-STAT3与Survivin在胃癌及其癌前病变组织中的表达及意义[J].中国医科大学学报,2009,38(12)：907-912.