低分子肝素对肺腺癌A549 裸鼠VEGF 表达影响

陈小军

（甘肃省人民医院 甘肃 兰州 730000）

肺癌是癌症最常见的恶性肿瘤之一，其生长和转移都需要新生血管的支持，多种信号分子共同参与并调控肿瘤新生血管生成，血管内皮细胞生长因子（VEGF）是目前已知活性最强的血管生成因子，可促进肿瘤血管生成，与肿瘤患者预后密切相关。本研究利用低分子肝素治疗肺腺癌A549 裸鼠模型，旨在明确低分子肝素对肿瘤生长的影响。

1.资料与方法

1.1 一般资料

研究时间为2019 年3 月—9 月，肺腺癌A549 细胞由本实验室保存，胎牛血清、DMEM 培养基、RPMI1640 培养基粉末购自美国Gibco 公司，抗VEGF 抗体购自美国Cell Signaling Techonlogy 公司。Balb/c 裸鼠（雄性，体质量为18±2g）30只由本单位所在实验动物中心提供，动物许可号：SYXK2019-0002。

1.2 肺腺癌A549 裸鼠模型的建立

肺腺癌A549 用含体积份数为10%胎牛血清的RPMI1640 培养基常规培养，传代3 次后，取对数生长期的细胞，制成瘤细胞悬液，细胞计数3×107/ml。取0.2ml 细胞悬液接种于Balb/c小鼠右腋下，以接种后2 ～9d 可在右腋下触摸到肿瘤结节（肿瘤平均直径≥5mm）为建模成功。

1.3 治疗方法

将所有建模成功的裸鼠平分为两组，模型组与肝素组，每组15 只。模型组：不给任何药物治疗。肝素组：饮水内加入肝素500IU/ml，持续应用观察4 周，2 次/周。

1.4 观察指标

（1）在治疗后4 周处死裸鼠，完整地剥离瘤组织，计算抑瘤率，抑瘤率=（模型平均瘤质量-处理组平均瘤质量）/模型组平均瘤质量×100%。（2）取处死大鼠的组织，采用免疫组化法分别检测VEGF 表达水平。制成标本，于4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜，加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液30min，0.01MPBS 清洗5min×3。加入配好的0.3%Triton×100 30min，0.01MKPBS 清洗5min×3。加入用血清稀释液稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS 洗5min×3。加入0.01MKPBS 稀释的的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS 洗5min×3。进行免疫组织化学显色，时间不超过30min，用蒸馏水迅速冲3 次后加入0.01MKPBS 终止反应，梯度酒精脱水、镜下拍照，记录VEGF 相对表达水平。

1.5 统计学方法

2.结果

2.1 抑瘤率对比

所有裸鼠均建模成功，表现为精神差、毛发脱落、活动度减少、皮毛缺少光泽，饲料消耗量减少。治疗4 周后肝素组的抑瘤率均显著高于模型组（P＜0.05），见表1。

表1 两组抑瘤率对比（±s，%）

表1 两组抑瘤率对比（±s，%）

组别 只数（n） 抑瘤率肝素组 15 45.11±4.39模型组 15 0.00±0.00 P-＜0.05

2.2 VEGF 阳性表达率对比

治疗4 周后肝素组的瘤组织VEGF 阳性表达率显著低于模型组（P＜0.05），见表2。

表2 两组瘤组织VEGF 阳性表达率对比（±s，%）

表2 两组瘤组织VEGF 阳性表达率对比（±s，%）

组别 只数（n） VEGF 阳性表达率肝素组 15 0.55±0.04模型组 15 2.87±0.09 P-＜0.05

3.讨论

由于各种因素影响，我国肺癌发病人数逐年增加，其病死率在全部恶性肿瘤中上升幅度最大。影响肺癌患者的预后因素比较多，其中一个重要因素为肿瘤转移。是由多种因素参与的复杂过程，涉及到肿瘤新生血管的形成与细胞外基质的降解等。低分子肝素已被广泛用于各种情况下的抗凝治疗，也具有其他广泛的生物学活性，能增强化疗药物效果[1]。低分子肝素可抑制肿瘤细胞在脏器毛细血管的滞留，阻断P-选择素和L-选择素与肿瘤细胞表面的粘蛋白配体的结合，影响内皮细胞释放的组织因子途径抑制剂和肿瘤细胞宿主相互作用，减少转移，且能促进肿瘤细胞凋亡[2]。血管生成的主要机制是血管内皮生长因子的过度表达来实现，新血管的形成是肿瘤转移、浸润的重要条件。作为肿瘤基质和毛细血管网形成的基础，VEGF 是特异性最高的血管生成调控因子，在肺癌组织中有较高的表达。本研究显示治疗4 周后肝素组的瘤组织VEGF 阳性表达率显著低于模型组（P＜0.05），表明低分子肝素能影响肿瘤新生血管的形成。低分子肝素能够通过影响血管内皮细胞与VEGF 的结合，增强抗凝血酶的作用，减少肝素酶对细胞外基质的分解，从而对肿瘤新生血管的形成产生抑制作用[3]。

综上，低分子肝素在肺腺癌A549 裸鼠中的应用能抑制VEGF的表达，具有很好的抑瘤效果。