山东地区Ⅰ型鸭肝炎病毒分离鉴定及单克隆抗体的研制＊

提金凤，李志杰，李 舫

（山东畜牧兽医职业学院，山东 潍坊 261061）

鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是由鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）引起的一种传播快速、急性高度致死性传染病，主要侵害1月龄以内的雏鸭。该病于1949年由Levine和Hofstad首次发现于美国的长岛，呈世界性分布，是危害养鸭业最为严重的传染病之一[1]。鸭病毒性肝炎的病原为DHV，可分为3个血清型，分别为Ⅰ型DHV、Ⅱ型DHV和Ⅲ型DHV[1－2]。DHV属于小RNA病毒科，病毒粒子呈正二十面体结构，其组成为衣壳蛋白和一条由衣壳蛋白包裹的长约7.7kb左右的单链正股RNA组成。Ⅰ型DHV流行最广泛且致病力最强，Ⅱ型DHV仅见于英国，Ⅲ型DHV 仅见于美国和中国，均呈偶发性[3－4]。

近年来，国内外也相继有关新型DHV （NDHV）的报道，但Ⅰ型DHV仍是发病的主要血清型。传统上对该病的治疗是采用卵黄抗体，但有时受卵黄抗体中非特异性蛋白或抗体滴度过低的影响，治疗效果较差。针对这种情况，本文从山东地区分离出一株Ⅰ型DHV并进行鉴定，然后对其进行单克隆抗体的研制，筛选出具有中和性的单克隆抗体，为以后进一步用单抗来进行该病的临床诊断和治疗提供方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 鸡胚、细胞系及实验动物 SPF鸡胚购自山东省农科院家禽研究所；6周龄的Balb／c小鼠以及8周龄～10周龄的昆明鼠购自山东大学医学院；小鼠骨髓瘤细胞SP2／0－Ag14由中国动物卫生与流行病学中心邵卫星博士馈赠。

1.1.2 主要试剂 PEG4000、高糖型 DMEM、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、L－谷氨酰胺、单克隆抗体亚类鉴定试剂盒、邻苯二胺（OPD）、辣根过氧化物酶（HRP）为Sigma公司产品；羊抗鼠IgG－HRP、羊抗鼠IgGM－HRP为华美公司产品；氨基喋呤为GIBCO BRL公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分离培养 从山东地区某鸭场（临床诊断为鸭病毒性肝炎）采集发病鸭的肝脏，在匀浆器中加入适量灭菌的生理盐水（一般按照1∶4的比例）后进行匀浆，组织液12000r／min 10min离心，取上清液，加入青霉素和链霉素在4℃过夜。然后将上清液经尿囊腔接种9日龄～11日龄的SPF鸡胚10枚，0.2mL／枚，另设生理盐水对照。37℃温箱中培养，观察5d～8d，并收集死亡胚的尿囊液[5]。

1.2.2 病毒的鉴定[6－7]

1.2.2.1 病毒中和试验 按照文献[2]进行。用灭菌生理盐水稀释收集获得的疑似DHV尿囊液，稀释至0.2mL病毒含量为200ELD50。取0.2mL与等量的Ⅰ型鸭肝炎病毒的阳性血清进行混合，37℃水浴作用30min，然后接种10枚SPF鸡胚，每只胚0.2mL，37℃温箱培养，观察5d～8d。

1.2.2.2 动物回归试验 将10只3日龄鸭肝炎病毒母源抗体阴性的雏鸭分为2组，5只／组。其中1组用获得的疑似DHV尿囊液及死亡胚体的混合物，颈部皮下注射进行攻毒，攻毒量为0.5mL／只；另1组设为对照组，颈部皮下注射生理盐水，0.5mL／只。隔离饲养，观察并记录结果。

1.2.2.3 RT－PCR鉴定 按照文献[8－9]进行。参考GenBank中已发布的血清型Ⅰ型DHV VP1基因序列，由宝生物工程（大连）有限公司合成引物。上游引物：5′－GAA TTC GGT GAT TCC AAC AGT TG －3′；下游引物：5′－GCG GCC GCT TCA ATT TCC AGA TTG－3′。划线处分别为限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ的识别位点。

用RNA提取试剂盒提取RNA进RT－PCR扩增。回收的PCR产物克隆至pMD18－T载体中，双酶切法进行阳性重组质粒鉴定。最后由宝生物工程（大连）有限公司完成测序。

1.2.2.4 免疫原和检测抗原的制备及鉴定 将已经鉴定的Ⅰ型DHV接种100枚9日龄～11日龄的SPF鸡胚，收集72h～96h死亡鸡胚的尿囊液，并将收集的尿囊液进行浓缩纯化。方法如下：先将尿囊液在4℃以12000r／min离心10min，取上清液，将上清液与等量的氯仿震荡混匀，在4℃ 以8000 r／min离心10min，取上清水相。然后将水相放在透析袋中4℃透析，透析液为50%的PEG4000。将透析后的浓缩液在4℃以12000r／min离心10min，取上清液。分光光度计测定DHV的浓度。

将纯化后的抗原经0.22μm滤器过滤后接种9日龄～11日龄的鸡胚，并设正常鸡胚作对照。记录鸡胚死亡及胚体病变情况。

1.2.3 杂交瘤细胞株的建立

1.2.3.1 免疫动物 取6周龄的 Balb／c小鼠，腹部皮下注射已浓缩纯化后的DHV，100μg／只，每隔2周免疫接种1次，第3次免疫接种后1周，眶下窦采血，用间接ELISA测定小鼠血清的OD值，若为阳性，1周后加强免疫1次，3d后融合。

1.2.3.2 融合 按照文献[10]方法，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的SP2／0细胞按3∶1的比例，用PEG4000诱导融合。

1.2.3.3 杂交瘤细胞的筛选及其克隆化 采用间接ELISA法进行筛选，将检测为阳性的孔中的细胞扩大培养，及时冻存，同时按照有限稀释法进行亚克隆至阳性率为100%，并制备腹水。

1.2.4 单克隆抗体特性的鉴定

1.2.4.1 亚类鉴定 用亚类鉴定试剂盒，采用抗原介导的ELISA 法（Atigen－Mediated ELISA），按其说明书所介绍的方法进行测定。

1.2.4.2 效价测定 取已定株的杂交瘤细胞株的培养上清和其腹水做倍比稀释，间接ELISA进行测定。

1.2.4.3 单克隆抗体特异性鉴定 用鸡胚尿囊液、DPV、EDS－76V、IBV、MDV 及 NDV等抗原点样，用Dot－ELISA检测所制备的单克隆抗体的反应性。

1.2.4.4 鸡胚中和特性测定 采用固定病毒－稀释单抗法进行中和特性鉴定。用灭菌生理盐水稀释已鉴定的DHV尿囊液，稀释至0.2mL病毒含量为200ELD50。取0.2mL与等量的1∶5、1∶10、1∶50稀释的单抗进行混合，37℃水浴作用30min，然后接种SPF鸡胚，每个稀释度接种4枚鸡胚，37℃温箱培养，观察5d～8d。另设生理盐水空白对照和病毒对照组。然后将单抗分别与本实验室已分离鉴定的7株Ⅰ型DHV（其中3株分离自潍坊地区、4株分离自济南地区）进行中和试验，并记录试验结果。

2 结果

2.1 病毒的分离鉴定

10枚SPF鸡胚均在接种后72～96h之间死亡，死亡的胚体水肿出血，尤其是头部、翅膀和腿部点状出血明显。剖检发现有的肝脏边缘白色坏死，有的肝脏上白色点状坏死呈斑驳状，有的肝脏发绿且边缘坏死。收集死亡鸡胚的尿囊液。

病毒中和试验结果表明，该分离毒株能被Ⅰ型鸭肝炎病毒的阳性血清中和。动物回归试验显示攻毒组雏鸭在72h内死亡率达100%，病死鸭主要表现角弓反张、剖检肝脏出血、胆囊充盈、充满茶色胆汁，肾脏肿胀、出血；对照组健康无变化。

2.2 RT－PCR鉴定

用RNA提取试剂盒提取RNA，并利用设计的引物进行Ⅰ型DHV VP1基因扩增，获得714bp大小的基因片段（图1）。回收的RT－PCR产物克隆至pMD18－T载体中，用限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ进行酶切鉴定（图2）。最后由宝生物工程（大连）有限公司完成测序。

2.3 免疫原和检测抗原的制备及鉴定

将浓缩纯化后的Ⅰ型DHV经分光光度计测定其蛋白质浓度，浓度为5mg／mL。

将纯化后的抗原经0.22μm滤器过滤后接种9日龄～11日龄的鸡胚，并设正常鸡胚作对照。鸡胚在72h～96h之间死亡，死亡的胚体水肿出血，肝脏上有白色坏死点，没有接种抗原的对照组鸡胚发育正常。

图1 Ⅰ型DHV VP1基因的RT－PCR产物Fig.1 RT－PCR products of DHV typeⅠ VP1gene

2.4 杂交瘤细胞株的建立

用间接ELISA方法，获得了一株针对Ⅰ型DHV的单抗杂交瘤细胞株，命名为3B2。传代培养后，依然能稳定分泌单抗。

2.5 单克隆抗体特性的鉴定

图2 重组质粒pMD－VP1的酶切结果Fig.2 Enzyme digestion of recombinant pMD－VP1

2.5.1 单克隆抗体的部分生物学特性 3B2单抗的亚类鉴定为IgG1，细胞上清与小鼠腹水的ELISA效价分别为1∶500和1∶100000。

2.5.2 单抗特异性及广谱性鉴定 本试验所获得的单抗与鸡胚尿囊液、DPV、EDS－76V、IBV、MDV和NDV等均不反应，特异性好。该单抗与本试验分离的7株Ⅰ型DHV均反应，具有一定的广谱性。2.5.3 中和特性鉴定 本试验所获得的单抗中和特性较好，能以该杂交瘤细胞上清的原倍中和鸡胚，并且和本试验分离的其他7株Ⅰ型DHV均能发生中和反应，广谱性较好，结果见表1、表2。

表1 单抗3B2细胞上清与DHV的Dot－ELISA反应结果Table1 Result of Dot－ELISA between the monoclonal antibody 3B2and DHV

表2 单抗3B2细胞上清与DHV中和反应结果Table2 Result of neutralization action between the monoclonal antibody 3B2and DHV

3 讨论

本研究通过鸡胚分离培养和各种鉴定，获得了一株Ⅰ型DHV。

DHV粒子的大小只有20nm～40nm，纯化较困难，参考杨萍萍等对DHV的纯化方法来浓缩纯化该病毒。该方法主要是利用DHV对脂溶剂不敏感，能耐受反复冻融，对外界环境的抵抗能力强等特点进行。通过处理，去除了绝大部分脂类和杂蛋白。浓缩后的DHV经测定病毒含量较高，杂质较少，可以作为制备单抗的免疫原和筛选抗原。由于作者所在实验室条件所限，无法对浓缩后的DHV利用层析法或其他方法进一步纯化，这可能会为单抗的筛选带来一定难度。再者，对病毒进一步纯化有可能会影响病毒的生物活性和病毒的结构，这会 破坏病毒的免疫性，可能筛选不到具有中和性的单抗。因此，关于DHV更好的纯化手段有待于进一步的研究[11]。

陈溥言等首先报道国内抗鸭肝炎病毒单抗的制备，之后杨萍萍等也做了报道[11]，但两者所制备的DHV单抗中和特性较差，限制了该单抗的应用。本研究旨在利用纯化后的病毒制备出具有中和特性的Ⅰ型DHV单抗。本研究的纯化抗原中可能会存在鸡胚尿囊液中的一些杂蛋白，进行单抗筛选时我们采用了双筛选法，即用DHV纯化抗原和正常鸡胚尿囊液抗原同时包被酶标板进行同步检测；为了获得具有中和特性的单抗，对筛选到的阳性克隆先进行扩大培养后先进行中和试验鉴定，对具有中和性的杂交瘤克隆再进行亚克隆和保存。这样就大大增加了获得中和性单抗的概率。

本研究获得了一株杂交瘤细胞株3B2，该杂交瘤细胞株上清液能中和病毒，具有较好的中和特性，且与本试验分离的其他7株Ⅰ型DHV均能发生中和反应，广谱性较好；而且该株杂交瘤的稳定性和特异性较好，为该单抗应用于实验室对Ⅰ型DHV检测、DHV病毒检测试剂盒的制备以及对DVH的抗病毒治疗等提供重要的生物试剂。

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