碱性β-甘露聚糖酶发酵培养基的优化

毕 静

碱性β-甘露聚糖酶发酵培养基的优化

毕 静

(江苏经贸职业技术学院工程技术学院，江苏 南京 211168)

选用魔芋粉作为碳源，豆饼粉和谷氨酸钠作为氮源物质，对发酵培养基进行优化，并进行模型验证和5L发酵罐生产实验。结果表明:最佳发酵培养基(g/L，5L发酵罐)为魔芋粉12、豆饼粉15、酵母粉5、NaCl 84.4、谷氨酸钠3.11、K2HPO4 1.5、MgSO4 0.3、Na2CO3 10，起始pH 9.5～10.0，碱性β-甘露聚糖酶活力最高可达到2610.1U/mL。

碱性甘露聚糖酶；培养基；优化；爬坡试验

碱性β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是纤维素酶类中的一种，广泛存在于自然界中。微生物来源的甘露聚糖酶具有酶活高、提取方便和成本低的特点，比动植物来源的有作用pH值、作用温度范围和底物专一性等更为广泛，已成为近年来的研究热点和工业用酶的主要来源[1]。但自然界中分离的微生物往往只能少量分泌碱性甘露聚糖酶，所以有研究者将微生物产生的碱性甘露聚糖酶基因克隆和测序，并在宿主细胞中表达[2-3]。但是由于表达水平不高，目前碱性甘露聚糖酶的工业化应用成功的较少；还有一些研究者尝试从菌种诱变及发酵条件优化的角度来提高酶产量[4]，但是这方面的研究工作偏少。本实验在已有的研究基础上，应用SAS软件进行中心组合试验设计对碱性甘露聚糖酶发酵培养基优化，以提高发酵液中的碱性甘露聚糖酶活，为工业化生产研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

嗜碱芽孢杆菌，从自然界分离得到。

1.2 培养基

发酵培养基(g/L):魔芋粉12、豆饼粉15、NaCl 80、谷氨酸钠1、酵母粉5、K2HPO41.5、MgSO40.3、Na2CO310，起始pH值调至7.5～8.0，121℃灭菌20min，加入Na2CO3使pH值至9.5～10.0[5]。

RSM试验基础培养基(g/L):魔芋粉12、豆饼粉15、酵母粉5、K2HPO41.5、MgSO40.3、Na2CO310。

R S M试验发酵培养基:将需考察的关键因子NaCl和谷氨酸钠配制成一定质量浓度的母液，再根据试验设计要求，吸取一定体积该母液添加到三角瓶中，余量用基础发酵培养基补齐后，按设计要求调p H值。

1.3 仪器与设备

5L发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；L2B-40转子流量计 浙江余姚流量仪器厂。

1.4 碱性β-甘露聚糖酶活力测定

在0.9mL、质量浓度为0.5g/100mL的槐豆胶中，加入0.1mL以pH 9.6 Gly-NaOH缓冲液作稀释的酶液于70℃水浴中保温10min，用DNS法测定还原糖。碱性β-甘露聚糖酶酶活力单位定义为:在上述条件下，每分钟水解出1μmol/L相当于D-甘露糖的还原糖基所需要的酶量为一个酶活单位。

1.55 L发酵罐实验

在5L发酵罐上进行验证实验。上罐条件为:优化后的发酵培养基3L，实罐121℃灭菌20min，接种量2%，培养温度37℃，起始pH9.5～10.0，通气量1.0vvm，搅拌速率500r/min。一般发酵培养周期为32～36h，酶活力不再增加时，即可放罐。

1.6 试验设计

1.6.1 Pluckett-Burman (PB)试验

Pluckett-Burman试验设计是一种两水平的试验设计方法，它基于不完全平衡块原理，能以最少的试验次数从众多变量中快速筛选出对实验结果影响最大的因素[6-8]。

本实验发酵培养基中有起始pH值、魔芋粉、豆饼粉、酵母粉、谷氨酸钠、NaCl、MgSO4和K2HPO4共8种成分，它们都对碱性β-甘露聚糖酶的产生有一定的影响。如果全部用来进行试验设计，费时费力。所以首先选用PB试验设计筛选出具有显著影响的因素。

本设计采用试验次数n＝12的PB设计对这8个因素进行考察，每个因素取两个水平，高水平(＋)和低水平(－)，PB试验因素水平设计见表1。

表1 PB试验因素水平设计Table 1 Factors and levels used in Pluckett-Burman design

1.6.2 最陡爬坡试验设计

最陡爬坡试验能最快逼进最大响应区域，确定中心组合试验的中心点，保证响应面分析结果的准确有效性。PB试验得出的一次拟合方程各变量的系数决定爬坡方向和变化步长，如果系数为负，则该因素水平应为递减，反之递增，系数越大变化步长越小[9]。

1.6.3 中心组合试验设计(CCD)

基于PB试验结果，以最陡爬坡试验得到的中心点，本阶段试验根据中心旋转组合设计(CCD)法，对影响碱性β-甘露聚糖酶的关键内部因素进行研究和探索。实验数据经多项式回归分析得到一个关于响应值与自变量关系的二价经验模型:

式中:Y为预测响应值(即碱性β-甘露聚糖酶活力)，bi为回归系数，Xi为自变量。Xi和X0的关系公式为:

式中:Xi为自变量，X0为自变量在中心点时的值，ΔXi为自变量变化的步长。

本实验均采用SAS软件9.0进行实验设计，并对实验数据作回归拟合，对拟合方程作显著性检验及方差分析。多项式模型方程拟和的性质由决定系数(R2)及方差分析判定，其统计学上的显著性由F检验确定。所得回归方程(1)分别对各自变量求偏导数并均令其为0，即可得一个二元一次方程组，通过解此方程组就可以得到碱性β-甘露聚糖酶的最大产出和对应的极值点[10]。

2 结果与分析

2.1 碱性甘露聚糖酶产出的关键影响因子的确定

根据试验方案，设计PB试验的自变量水平[11]。根据SAS软件自动生成的八因素二水平的组合，对原始培养基8种成分进行考察，筛选影响碱性β-甘露聚糖酶产出的重要因素。PB试验结果见表2，其回归分析见表3。

表2 PB试验设计及结果Table 2 Pluckett-Burman design arrangement and corresponding experimental results

表3 PB试验结果的回归分析Table 3 Regression analysis of the Pluckett-Burman experimental results

为保证结果可靠性，每个试验组合设置3个平行，响应值Y为碱性β-甘露聚糖酶活力的平均值。用SAS软件对实验数据进行回归分析，得到一次回归方程:

该模型方程的R2为0.9559，证明该模型极其显著且合适有效。根据表3中t检验结果可知，NaCl和谷氨酸钠为主要影响因素，在95%和99%置信区间其可信度分别为96.76%和99.38%。

2.2 培养基组成对碱性β-甘露聚糖酶产量的影响

2.2.1 中心组合试验中心点的确定

根据PB试验结果可知，NaCl和谷氨酸钠加入量为产碱性β-甘露聚糖酶的主要影响因素。由方程(1)可知NaCl的系数为负，说明实验水平下降对碱性β-甘露聚糖酶的产出有积极的影响；谷氨酸钠的系数为正，说明实验水平上升对产酶有积极的影响。确定NaCl和谷氨酸钠的变化步长分别为5g/L和0.2g/L进行最陡爬坡试验。魔芋粉、豆饼粉、酵母粉、K2HPO4、MgSO4、Na2CO3添加质量浓度和起始pH值保持原水平。试验设计及结果如表4所示。可知后续中心组合试验的中心点为NaCl 85.0g/L、谷氨酸钠3.0g/L。

表4 最陡爬坡试验设计及其结果Table 4 Steepest ascent test arrangement and corresponding experimental results

2.2.2 碱性β-甘露聚糖酶的中心组合试验分析与优化

根据最陡爬坡试验得到的中心点，对NaCl和谷氨酸钠进行中心试验组合设计，魔芋粉、豆饼粉、酵母粉、K2HPO4、MgSO4、Na2CO3添加量和起始pH值保持原水平。为使拟合方程具有旋转性和通用性，中心点重复4次，星号臂长γ＝1.414[12-15]。自变量水平及编码，试验设计及结果见表5，二次多项模型方差分析见表6，回归方程系数及其显著性分析见表7。

表5 中心组合试验设计及结果Table 5 Central composite design (CCD) arrangement and corresponding experimental results

表6 二次多项模型方差分析表Table 6 Variance analysis of the fitted quadratic polynomial model based on CCD design

表7 回归方程系数及其显著性检验Table 7 Regression coefficients and their significance for the regression model based on CCD design

利用SAS9.0软件，对实验数据进行二次多项回归拟合，获得了二次经验模拟方程:

二次多项模型方差分析确定显著因素，由表6的方差分析结果表明，方程差异极显著(P＝0.0001)，而且各因素系数均有意义(表7)，说明方程的显著性及可靠性极高。

考察的NaCl和谷氨酸钠的质量浓度范围分别为78～92g/L和2.4～3.6g/L时，当NaCl 和谷氨酸钠质量浓度达到80～90g/L和2.8～3.6g/L 时为最适产酶质量浓度。在较低质量浓度NaCl和较高质量浓度谷氨酸钠时，可以达到最高酶活力，得到模型极值点为X1＝－0.120、X2＝0.276，对应NaCl 84.4g/L、谷氨酸钠3.11g/L，此时预测碱性β-甘露聚糖酶活力为2605U/mL。

2.3 模型验证

为验证模型准确性和有效性，根据方程(2)得到NaCl和谷氨酸钠的质量浓度，配制发酵培养基，即最佳发酵培养基(g/L):魔芋粉12、豆饼粉15、酵母粉 5、NaCl 84.4、谷氨酸钠 3.11、K2HPO41.5、MgSO40.3、Na2CO310，起始pH 9.5～10.0进行摇瓶发酵实验，得到碱性β-甘露聚糖酶实际酶活力，实验重复3次，取平均值为2695.0U/mL，符合模型预测值(2688.5U/mL)，可见该模型能准确预见实际发酵情况。

2.45 L发酵罐结果

按照优化后的培养基，在5L发酵罐上进行碱性β-甘露聚糖酶生产实验，结果显示，碱性β-甘露聚糖酶活力最高可达到2610.1U/mL，比初始培养基产酶水平(1671U/mL)提高56.2%。可见，该模型能准确预见实际发酵情况，提高碱性β-甘露聚糖酶的产量。

3 结 论

选定魔芋粉作为碳源，豆饼粉和谷氨酸钠作为氮源物质，对发酵培养基进行优化，最佳发酵培养基(g/L):魔芋粉12、豆饼粉15、酵母粉5、NaCl 84.4、谷氨酸钠3.11、K2HPO41.5、MgSO40.3、Na2CO310，起始pH 9.5～10.0，进行摇瓶发酵实验，碱性β-甘露聚糖酶活力为2695.0U/mL，符合模型预测值2688.5U/mL。在5L发酵罐上进行碱性β-甘露聚糖酶生产实验，结果显示，碱性β-甘露聚糖酶活最高可达到2610.1U/mL，比初始培养基产酶水平(1671U/mL)提高56.2%。可见，该模型能准确预见实际发酵情况，提高了碱性β-甘露聚糖酶的产量。

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Optimization of Fermentation Medium for Alkaline Mannanase Production

BI Jing
(College of Engineering and Technology, Jiangsu Institute of Economic and Trade Technology, Nanjing 211168, China)

The fermentation medium for producing alkaline mannose using konjac flour as the carbon source and soybean cake powder and sodium glutamate as the nitrogen source was optimized by Pluckett-Burman (PB) design, steepest ascent test and central composite design. Based on a central composite design for three independent variables including NaCl and sodium glutamate concentrations, a predictive mathematical model was built and validated. Meanwhile, scale-up production experiments were done in a 5-L fermentor. Our results indicated that the optimal fermentation medium (g/L) was composed of konjac flour 12, soybean cake powder 15, yeast powder 5, NaCl 84.4, sodium glutamate 3.11, K2HPO41.5, MgSO40.3, Na2CO310, and initial pH 9.5—10.0, yielding an alkaline mannose as high as 2610.1 U/mL.

alkaline mannanase；medium；optimization；steepest ascent test

Q556.2

A

1002-6630(2012)15-0266-04

2012-03-12

毕静(1965—)，女，工程师，本科，研究方向为食品工程。E-mail:zyz0878@139.com