滁菊总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

俞 浩，肖 新，刘汉珍，周金星，马世堂，张孝林

(安徽科技学院食品药品学院，安徽 蚌埠 233100)

滁菊总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

俞 浩，肖 新，刘汉珍，周金星，马世堂，张孝林

(安徽科技学院食品药品学院，安徽 蚌埠 233100)

目的：观察滁菊总黄酮对Wistar大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的作用。方法：采用结扎冠状动脉左前降支30min后再灌注60min的方法复制急性MIRI大鼠模型，观察滁菊总黄酮对MIRI大鼠心肌梗死范围，血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性，血清及心肌中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量，体外血栓长度及干、湿质量，全血及血浆黏度的影响。结果：滁菊总黄酮能显著减小MIRI大鼠心肌梗死范围，降低血清CK、LDH活性，升高血清和心肌组织中SOD活性，降低MDA含量和体外血栓长度，减轻血栓干、湿质量，改善全血黏度。结论：滁菊总黄酮对大鼠MIRI具有保护作用。

滁菊总黄酮；Wistar大鼠；心肌缺血再灌注损伤；脂质过氧化

滁菊为菊科植物菊(Chrysanthemum morifoliumRamat.)的干燥头状花序，产于安徽滁州，为我国享有盛名的道地药材之一[1]。其味辛、甘、苦，性微寒，具有疏散风热、清肝明目、清热解毒之功效，尤偏于平肝阳，常用于治疗肝阳上亢所致的头晕目眩等症[2]。《中药志》载：“滁菊花主产于安徽滁县，品质最佳”[3]。《现代实用中药》载：“安徽滁州产者菊花最清凉，不苦不甜，白菊中以此为最良。俗谓杭菊湿，亳菊、徽菊燥，滁菊不湿不燥，故江浙一带名医处方中常以滁菊代替其他菊花，而其他菊花不能代替滁菊”[4]。可见，“四大名菊”中滁菊药用价值最高。研究表明，菊花具有扩血管、降血压、强心、抗心肌缺血、抗脑缺血、抗脂质过氧化损伤等多种药理作用，其主要活性成分有黄酮、多糖和挥发油等[5-6]。但当前有关滁菊及其活性成分的药理作用研究尚未见文献报道，本研究通过复制急性心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injuy，MIRI) Wistar大鼠模型，观察滁菊总黄酮对大鼠MIRI的作用，为以滁菊总黄酮为原料的保健食品及新药的开发研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

健康雄性Wistar大鼠，购于安徽长临河医药科技有限公司，体质量240～280g。

滁菊总黄酮(总黄酮含量为76.38%) 安徽科技学院中药及药物制剂实验室制备；黄杨宁片 南京小营药业集团有限公司；戊巴比妥钠 德国默克制药公司；CK、LDH、SOD、MDA试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

DL-5低速离心机 郑州长城科工贸易有限公司；FA21048电子天平 上海市精密科学仪器总厂；YDA-IV血液黏度计、体外血栓形成血小板黏附两用仪 北京宏润达科技发展有限公司；TU1810SPC紫外分光光度计北京普析通用仪器公司；HH-4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 受试药物的配制

分别称取滁菊总黄酮适量，用生理盐水溶解，配制成质量浓度为10.4、5.2、2.6mg/mL的滁菊总黄酮溶液。称取黄杨宁适量，用生理盐水溶解，配制成质量浓度为0.12mg/mL的黄杨宁溶液。

1.3.2 动物分组与给药

取大鼠84只，随机分为6组，即滁菊总黄酮高、中、低剂量组(剂量分别为40、20、10mg/(kg·d))、黄杨宁片组(剂量为0.6mg/(kg·d))、模型组和假手术组，每组14只。各组大鼠均于每日上午9:00时灌胃给药，每日1次，连续5d，给药容量均为5mL/kg体质量。假手术组和模型组给等容量的生理盐水。

1.3.3 模型制备

参照文献[7-10]方法并适当改进复制MIRI大鼠模型，末次给药后1h，腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉大鼠，仰位固定，手术部位剪去毛，常规消毒皮肤，用止血钳于左胸部4、5肋间隙打开胸腔，挤出心脏，在肺动脉圆锥左缘，左心耳根部下缘1～2mm处与冠状动脉左前降支平行放置一实心硅胶管，用5/0无损伤缝合针结扎冠状动脉左前降支及硅胶管，然后立即将心脏放回胸腔并缝合，使硅胶管一端暴露于胸腔外。以结扎后10min大鼠心电图T波出现高耸或倒置为模型成功。结扎30min后，拔出硅胶管，恢复冠状动脉左前降支血流，再灌注60min。假手术组重复上述操作过程但不结扎冠状动脉左前降支。每组选成模大鼠10只。

1.3.4 心肌梗死范围的测定

大鼠经再灌注60min后，打开胸腔，分离心脏，生理盐水洗净余血，滤纸吸尽水分，剪取缺血区下心肌，将心肌切成4～5片，每片厚约0.1cm，取3片置0.5g/100mL的氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色液中，37℃恒温水浴中染色15min，取出，滤纸吸尽水分，称质量；分离梗死区(该区域呈白色)，称质量；计算梗死范围。

1.3.5 血清CK、LDH、SOD活性及MDA含量的测定

大鼠经再灌注60min后，剪开腹腔，腹主动脉取血于试管中，静置30min，4200r/min离心15min，取上清，按试剂盒操作方法测定大鼠血清中肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.3.6 心肌中SOD活性、MDA含量的测定

大鼠经再灌注60min后，剪开胸腔，取心脏，生理盐水洗净，滤纸吸尽水分，于缺血区近心尖处取心肌，称质量，置玻璃匀浆器中，按质量体积比1:9加生理盐水匀浆，匀浆液4200r/min离心15min，取上清，按试剂盒操作方法测定大鼠心肌中SO D活性、MD A含量。

1.3.7 体外血栓长度及干、湿质量测定

腹主动脉取血，取1mL迅速注入血栓管中，并将血栓管两端对接形成环状，固定于体外血栓形成血小板黏附两用仪上，旋转15min，取出血栓，测定血栓长度。滤纸吸净血栓中水分，称质量，得血栓湿质量。然后将血栓置65℃烘箱中干燥1h，取出称质量，得血栓干质量。

1.3.8 全血黏度、血浆黏度的测定

取0.8mL抗凝血置血液黏度计中，测定全血黏度。将剩余抗凝血置离心机上4200r/min离心15min，取上清液0.8mL置血液黏度计中，测定血浆黏度。

1.4 数据处理与统计

2 结果与分析

2.1 滁菊总黄酮对MIRI大鼠心肌梗死范围的影响

表1 滁菊总黄酮对MIRI大鼠心肌梗死范围的影响(±s，n=10)Table 1 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium (Ramat) Tzvel. cv.Chuju flowers on myocardial infarction area in MIRI rats(±s，n=10)

表1 滁菊总黄酮对MIRI大鼠心肌梗死范围的影响(±s，n=10)Table 1 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium (Ramat) Tzvel. cv.Chuju flowers on myocardial infarction area in MIRI rats(±s，n=10)

注：*.与模型组比较，差异显著(P＜0.05)；**.与模型组比较，差异极显著(P＜0.01)。下同。

组别 剂量/(mg/(kg·d))缺血心肌质量/g 梗死区质量/g 梗死范围/%模型组 0.47±0.12 0.16±0.04 36.90±8.71假手术组 0.43±0.10黄杨宁片组 0.6 0.46±0.11 0.10±0.03 23.10±10.87**高剂量组 40 0.51±0.08 0.12±0.03 24.30±5.62**滁菊总黄酮 中剂量组 20 0.46±0.04 0.12±0.04 25.60±9.97**低剂量组 10 0.51±0.09 0.16±0.03 32.90±8.67

由表1可知，滁菊总黄酮高、中剂量组均能显著减小MIRI大鼠心肌梗死范围，与模型组比较具有极显著性差异(P＜0.01)，说明滁菊总黄酮能够减轻MIRI所致的心肌梗死程度。

2.2 滁菊总黄酮对MIRI大鼠血清CK、LDH活性的影响

表2 滁菊总黄酮对MIRI大鼠血清中CK、LDH活性的影响(±s，n=10)Table 2 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on the activities of CK and LDH in serum of MIRI rats (±s，n=10)

表2 滁菊总黄酮对MIRI大鼠血清中CK、LDH活性的影响(±s，n=10)Table 2 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on the activities of CK and LDH in serum of MIRI rats (±s，n=10)

组别 剂量/(mg/(kg·d) CK活性/(U/mL) LDH活性/(U/mL)模型组 56.69±4.48 11.23±2.36假手术组 27.60±8.38** 1.65±0.35黄杨宁片组 0.6 38.29±8.67** 3.62±1.21**高剂量组 40 32.31±6.47** 4.82±1.37**滁菊总黄酮 中剂量组 20 34.32±5.68** 5.79±3.27**低剂量组 10 45.29±5.86** 6.99±2.48**

由表2可知，模型大鼠血清中CK、LDH活性显著升高，滁菊总黄酮高、中、低剂量组大鼠血清中CK、LDH活性显著下降，与模型组比较具有极显著性差异(P＜0.01)，说明滁菊总黄酮能够降低MIRI引起的大鼠血清CK、LDH活性的升高。

2.3 滁菊总黄酮对MIRI大鼠血清及心肌中SOD活性、MDA含量的影响

由表3可知，缺血再灌注后模型大鼠血清及心肌组织中SOD活性显著下降，MDA含量显著升高。滁菊总黄酮高、中剂量组大鼠血清中SOD活性显著升高，与模型组比较具有极显著性差异(P＜0.01)；滁菊总黄酮高、中、低剂量组大鼠血清中MDA含量显著下降，与模型组比较具有极显著性差异(P＜0.01)。滁菊总黄酮高、中剂量组大鼠心肌中SOD活性显著升高，MDA含量显著下降，与模型组比较具有极显著性差异(P＜0.01)，说明滁菊总黄酮能够改善MIRI引起的过氧化损伤。

2.4 滁菊总黄酮对MIRI大鼠血栓长度和干、湿质量的影响

表4 滁菊总黄酮对MIRI大鼠体外血栓长度和干、湿质量的影响(±s，n=10)Table 4 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on thrombus length as well as dry and wet weight of thrombi in MIRI rats (±s，n=10)

表4 滁菊总黄酮对MIRI大鼠体外血栓长度和干、湿质量的影响(±s，n=10)Table 4 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on thrombus length as well as dry and wet weight of thrombi in MIRI rats (±s，n=10)

组别 剂量/(mg/( kg·d)) 血栓长度/cm 血栓湿质量/g 血栓干质量/g模型组 5.93±1.18 0.64±0.16 0.29±0.11假手术组 3.32±1.14 0.30±0.12 0.13±0.09黄杨宁片组 0.6 3.16±0.19** 0.32±0.21* 0.14±0.04**高剂量组 40 3.08±0.91** 0.29±0.15** 0.16±0.03**滁菊总黄酮 中剂量组 20 3.45±1.13** 0.54±0.16 0.24±0.10低剂量组 10 4.61±2.01 0.55±0.12 0.26±0.14

表3 滁菊总黄酮对MIRI大鼠血清及心肌组织中SOD、MDA含量的影响(±s，n=10)Table 3 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium (Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on SOD activities and MDA contents in serum and myocardium of MIRI rats (± s，n=10)

表3 滁菊总黄酮对MIRI大鼠血清及心肌组织中SOD、MDA含量的影响(±s，n=10)Table 3 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium (Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on SOD activities and MDA contents in serum and myocardium of MIRI rats (± s，n=10)

组别 剂量/(mg/(kg·d)) 血清 心肌组织SOD活性/(NU/mL) MDA含量/(nmol/mL) SOD活性/(IU/mg) MDA含量/(nmol/mg)模型组 176.66±20.87 13.17±2.81 49.92±6.38 10.21±3.36假手术组 266.70±26.29 4.21±1.89 78.40±6.31 2.37±0.58黄杨宁片组 0.6 235.29±28.60** 5.99±1.93** 64.31±4.75** 4.48±1.39**高剂量组 40 224.58±31.23** 6.12±2.49** 66.82±3.38** 4.86±2.24**滁菊总黄酮 中剂量组 20 220.92±11.89** 8.02±2.17** 58.46±4.41** 6.54±3.41**低剂量组 10 198.44±25.77 9.83±1.37** 51.32±9.42 8.90±4.21

表5 滁菊总黄酮对MIRI大鼠全血黏度、血浆黏度的影响 (±s，n=10)Table 5 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium (Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on viscosity of whole blood and plasma in MIRI rats(±s，n=10)

表5 滁菊总黄酮对MIRI大鼠全血黏度、血浆黏度的影响 (±s，n=10)Table 5 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium (Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on viscosity of whole blood and plasma in MIRI rats(±s，n=10)

组别 剂量/(mg/(kg·d)) 全血黏度/(mPa·s) 血浆黏度/(mPa·s)高切 中切 低切模型组 5.61±0.50 8.04±0.53 14.26±1.85 1.59±0.04假手术组 3.27±0.37 5.03±0.28 11.82±1.15 1.51±0.13黄杨宁片组 0.6 4.19±0.45** 5.23±1.02** 11.85±1.16** 1.52±0.10高剂量组 40 4.24±0.38** 5.51±0.23** 11.89±1.43** 1.52±0.18滁菊总黄酮 中剂量组 20 4.42±0.48** 5.48±0.35** 11.91±1.36** 1.53±0.26低剂量组 10 4.51±0.33** 5.60±0.16** 12.03±1.32* 1.55±0.09

由表4可知，滁菊总黄酮高、中剂量组血栓长度显著低于模型组，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.01)；滁菊总黄酮高剂量组血栓湿、干质量均显著低于模型组，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.01)。结果表明滁菊总黄酮具有抑制血栓形成的作用。

2.5 滁菊总黄酮对MIRI大鼠全血黏度、血浆黏度的影响

由表5可知，与模型组比较，滁菊总黄酮高、中、低剂量组均能显著降低大鼠全血黏度(P＜0.05或P＜0.01)，说明滁菊总黄酮具有降低大鼠全血黏度作用；滁菊总黄酮各剂量组对MIRI大鼠血浆黏度有一定的降低作用，但与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)。

3 讨 论

MIRI是指缺血心肌组织在恢复血流后，心肌供血改善的同时又加重了单纯性心肌缺血所造成的损伤，其发生机制主要与氧自由基损伤、钙超载及血管内皮细胞抗氧化系统功能障碍有关。

NBT能与活性酶作用，缺血性损伤达一定程度时，心肌组织中能量代谢障碍，酶活性降低或消失，故正常心肌被染成蓝色，而梗死区不着色。血清中 LDH 活性是反映心肌缺血程度的一个重要指标，CK是心肌细胞损伤最敏感的指标之一。MIRI能造成细胞膜通透性增加，导致心肌细胞内各种酶释放入血，通过检测血清中LDH、CK的变化可以间接判断心肌受损情况[11-12]。本实验结果表明，滁菊总黄酮能显著减小MIRI大鼠心肌梗死范围，降低血清中CK、LDH活性，说明滁菊总黄酮能对抗缺血再灌注引起的心肌损伤。

自由基介导的脂质过氧化是MIRI的重要环节，MIRI导致自由基生成增加，使心肌细胞中不饱和脂肪酸发生脂质过氧化。SOD是超氧自由基的清除剂，对保护心肌细胞免受自由基损伤起重要作用。MDA是脂质过氧化的产物，间接地反映心肌细胞脂质过氧化程度。MIRI时由于自由基清除酶的活性降低，导致氧自由基堆积，进而使生物膜发生脂质过氧化反应，细胞膜的结构和功能损伤[13-15]。滁菊总黄酮能显著升高血清和心肌组织中SOD活性，降低MDA含量，提示滁菊总黄酮能抑制MIRI引起的脂质过氧化损伤。

研究表明，MIRI时造成的Ca2+转运异常和氧自由基引起的红细胞膜损伤等均可导致膜的稳定性和流动性降低，血浆纤维蛋白原生成增加，导致红细胞变形能力下降，聚集性增高。同时，MIRI造成血管内皮损伤，使微循环血流紊乱，红细胞聚集性进一步增强，导致血黏度增加，血黏度的增加又促进了血栓的形成，进一步加重MIRI[16]。本实验研究表明滁菊总黄酮能降低体外血栓长度和干、湿质量，降低全血黏度，从而有效防止血栓形成，改善缺血心肌的血液供应，促进MIRI的恢复。

本研究在载体MIRI大鼠模型的基础上证实滁菊总黄酮具有抗MIRI作用，通过体外实验证实滁菊总黄酮的抗MIRI作用以及明确其抗MIRI的机制有待进一步去研究。

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Effect of Total Flavonoids fromDendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju Flowers on Myocardial Ischemia Reperfusion Injury in Rats

YU Hao，XIAO Xin，LIU Han-zhen，ZHOU Jin-xing，MA Shi-tang，ZHANG Xiao-lin
(College of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Bengbu 233100, China)

Objective: To observe the effect and underlying mechanism of total flavonoids extracted fromDendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on myocardial ischemia reperfusion injury (MIRI) in rats. Methods: Acute MIRI mouse models were created by reperfusion for 60 min after anterior interventricular branch of the left coronary artery for 30 min.The infarction area of myocardium, serum creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH) activities, SOD activity in serum and myocardium, and MDA content in serum and heart tissue were determined. Thrombus length, dry and wet weight of thrombi, and viscosity of whole blood and plasma were also evaluated. Results: Total flavonoids romDendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers could decrease the infarction area of myocardium, reduce serum CK and LDH activity,improve the activity of SOD in serum and heart tissue, decrease MDA content in serum and heart tissue, reduce thrombus length,wet weight and dry weight of thrombiin vitro, and improve the viscosity of whole blood. Conclusion: Total flavonoids fromDendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers can protect against MIRI in rats.

total flavonoids fromDendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers；Wistar rat；myocardial ischemia reperfusion injury；lipid preoxidation

R965.1

A

1002-6630(2012)15-0283-04

2011-08-19

安徽省自然科学基金项目(10040606Q13)；科技部科技人员服务企业行动项目(2009GJC30034)；安徽科技学院稳定人才项目(ZRC2011297)

俞浩(1975—)，男，副教授，博士，研究方向为中药药理学和保健食品学。E-mail：yhz_1230@163.com