猪小肠肠粘膜/浆膜/肠衣中的粘多糖组成分析

高照明，曹现平，张迎迎，张玉冰

(青岛科技大学化学与分子工程学院，山东 青岛 266042)

2008年初，美国及欧洲等12个国家发生了严重的肝素钠注射液不良反应事件[1]，数百例病人出现过敏反应，表面皮肤水肿，心跳过快，血压过低，恶心呕吐[2]，约百例病人死亡[3]。自美国FDA应用1HNMR和CE查出此批肝素钠(Heparin sodium，HP)原料中存在类肝素钠杂质——多硫酸软骨素(Oversulfated chondroitin sulfate，OSCS)[2]，可能为引起病人不良过敏反应的异常杂质[4]之后，在数批肝素钠及低分子肝素钠中均发现了OSCS[5]。究竟OSCS是否为致命的罪魁祸首，各国专家从分子结构、药理、临床、来源等方面对其进行了论证[2～6]。Kishimoto等[7]证实OSCS是引发过敏反应的污染物，其在血浆中激活激肽释放酶产生缓激肽，诱发了过敏毒素的产生。Zhang等[3]证实杂质硫酸皮肤素(Dermatan sulfate，DS)、硫酸软骨素(Chondroitin sulfates，CS)无毒，而OSCS有毒，可能是导致百例病人死亡的原因。

关于OSCS的来源引起了各国科学家的纷争：Guerrini等[2]认为OSCS不是天然存在的，而是人工合成的;Pan等[8]指出肝素钠事件中，OSCS并不是未分级肝素钠中唯一的污染物，与人工合成OSCS相比，OSCS更可能来源于多硫酸化的糖胺聚糖废料;Keire等[9]认为OSCS是人工半合成的，是人为添加到肝素钠中的。

作者在此从肝素钠的来源——猪小肠着手，将猪小肠分离为肠粘膜、浆膜、肠衣三部分并分别酶解提取其中的粘多糖，进而对粘多糖成分进行分析，以期对OSCS的来源进行深入研究。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜猪小肠购于青岛李沧西流庄市场。

胰蛋白酶、D-254树脂，青岛九龙生物医药有限公司；重水(D2O)，氘代度99.8％，CIL公司；三甲基硅丙磺酸钠(TSP)，氘代度98％，Sigma公司；NaCl、HCl、乙醇，分析纯，青岛正业化学试剂厂。

Bruker AV500型核磁共振波谱仪，瑞士Bruker公司。

1.2 肠粘膜、浆膜、肠衣中粘多糖的提取

将新鲜猪小肠洗净，用竹刀轻刮出肠粘膜并收集；再将猪小肠最外层的浆膜剥离并收集；剩余部分即为肠衣。

将肠粘膜/浆膜/肠衣投入反应锅，按其质量的5％加入胰蛋白酶，用3 mol·L-1的NaOH溶液调pH值为8～9，同时搅拌升温至40 ℃左右，维持2.5 h；再升温至60 ℃，按肠粘膜/浆膜/肠衣质量的2％加入NaCl，升温至90 ℃，调pH值为6～7，加热至沸腾，保持10 min，趁热用200目尼龙筛过滤；待滤液冷却至60 ℃左右，用3 mol·L-1的 NaOH溶液调pH值为8～9，按滤液量的5％加入D-254树脂，搅拌吸附6 h，静置1 h(吸附过程保持pH值为8～9)，过200目尼龙筛；在树脂中加入等体积自来水漂洗数次，用pH值为10的3 mol·L-1NaCl溶液搅拌洗脱树脂2 h(NaCl溶液用量与树脂量相等)；过200目尼龙筛，收集滤液；重复洗脱2次，合并滤液；在滤液中加入等体积乙醇，搅拌10 min，静置12 h以上；收集下层沉淀物，用乙醇脱水3次；将沉淀物置60 ℃烘箱中烘干，得粘多糖。

1.3 分析检测

采用1HNMR对提取的粘多糖进行定性、定量分析。

1H的共振频率为500.03 MHz；脉冲序列(PULPROG)为zgcppr；采样次数(NS)为100次；谱宽(SWH)为9615.385 Hz；采样时间(AQ)为3.407940 s；温度(TE)为298 K；驰豫时间(D1)为10.00 s。

2 结果与讨论

2.1 HP、CS、DS、OSCS的1HNMR特征峰归属

CS、DS、OSCS作为HP的类似物质与HP在结构等方面十分相似，故测定HP中的CS、DS、OSCS有一定难度，本实验从每种物质的USP鉴别标准品的1HNMR研究入手，找出能代表每种物质的特征峰，使得分析HP中的类似物质变得简单可行。HP、CS、DS、OSCS的1HNMR图谱见图1。

图1 HP、CS、DS、OSCS的1HNMR图谱

由图1可以看出：每种单一物质的糖环区域质子化学位移均集中在3.0～6.0 ppm之间，且重叠、复杂，无从分析，但在化学位移2.0 ppm左右均有尖锐独立的单峰，容易分析；HP、CS、DS、OSCS二糖单元中N-乙酰氨基中甲基的信号分别出现在化学位移(ppm)2.04、2.03(CS-A)、2.02(CS-C)、2.08、2.15处，虽然化学位移相近但并不相同。故确定这4种类似物质的1HNMR的特征峰分别为2.04 ppm、2.03 ppm(CS-A)、2.02 ppm(CS-C)、2.08 ppm、2.15 ppm，运用各自特征峰分析HP中的杂质变得简单可行。

为了验证在同一批肝素钠样品中各特征峰是否能分开，将上述4种物质按比例(HP∶CS∶DS∶OSCS=60∶10∶25∶5)混合，其1HNMR图谱见图2。

图2 肝素钠混合品的1HNMR图谱

由图2可以看出，肝素钠混合品中含有OSCS、DS、CS等杂质，并能通过特征峰峰高方便地计算出各自含量[10，11]。

2.2 肠粘膜、浆膜、肠衣酶解产物的粘多糖成分的定性分析

6 kg的新鲜猪小肠经分离后得到3.6 kg肠粘膜、0.9 kg浆膜、1.5 kg肠衣，再经过酶解、盐解、去蛋白核酸、树脂吸附、洗脱、沉淀、烘干，得到褐黄色的2.58 g肠粘膜产品、0.66 g浆膜产品、1.08 g肠衣产品。用1HNMR分别对其进行定性分析，结果见图3。

图3 肠粘膜(a)、浆膜(b)、肠衣(c)的1HNMR图谱

由图3a可以看出，肠粘膜粘多糖的主要成分为HP(δ2.04)，且含有DS(δ2.08)、CS-C(δ2.02)等杂质，但δ2.15左右无特征峰出现，说明不含OSCS杂质。峰高(Peak height，PKH)大小依次为：PKHHP>PKHDS>PKHCS-C，说明杂质的相对含量DS>CS-C。

由图3b可以看出，浆膜粘多糖的主要成分为HP(δ2.04)和DS(δ2.08)，且含有CS-C(δ2.02)杂质，但δ2.15左右无特征峰出现，说明不含OSCS杂质。PKHDS≈PKHHP>PKHCS-C，说明DS与HP含量相当，含有少量杂质CS-C。

由图3c可以看出，肠衣的主要成分为DS(δ2.08)，且含有HP(δ2.04)，CS-A(δ2.03)、CS-C(δ2.02)等杂质，但δ2.15左右无特征峰出现，说明不含OSCS杂质。PKHDS>PKHHP>PKHCS-A>PKHCS-C，说明杂质的相对含量HP>CS-A>CS-C。

2.3 肠粘膜、浆膜、肠衣酶解产物的粘多糖成分的定量分析

根据1HNMR图谱(图3)中的各特征峰峰高对各成分进行定量分析，结果见表1。

表1 肠粘膜、浆膜、肠衣中粘多糖的定量分析

从表1可以看出：肠粘膜粘多糖中，HP占47.23％，DS占36.95％，CS-C占15.81％，不含CS-A和OSCS杂质，产物总质量为2.58 g，故HP、DS、CS-C的含量分别为1.22 g、0.95 g和0.41 g，其中含量最高的为HP，其它含量DS>CS-C；浆膜粘多糖中，HP占43.62％，DS占44.77％，CS-C占11.61％，不含CS-A和OSCS杂质，产物总质量为0.66 g，故HP、DS、CS-C的含量分别为0.29 g、0.30 g、0.08 g，其中DS和HP的含量相当，CS-C含量相对较少；肠衣粘多糖中，HP占31.46％，DS占38.52％，CS-C占13.61％，CS-A占16.42％，不含OSCS杂质，产物总质量为1.08 g，故HP、DS、CS-C、CS-A的含量分别为0.34 g、0.42 g、0.15 g和0.18 g，其中含量最高的为DS，其它含量HP>CS-A>CS-C。

将肠粘膜、浆膜、肠衣的粘多糖峰高百分比与含量列表进行比较，结果见表2。

表2 肠粘膜、浆膜、肠衣中粘多糖组成比较

由表2可以看出：

(1)HP在肠粘膜中占47.23％，在浆膜中占43.62％，在肠衣中占31.46％。故，HP在各部分的百分含量大小依次为：肠粘膜>浆膜>肠衣；HP在各部分的含量大小依次为：肠粘膜(1.22 g)>肠衣(0.34 g)>浆膜(0.29 g)。

(2)DS在肠粘膜中占36.95％，在浆膜中占44.77％，在肠衣中占38.52％。故，DS在各部分的百分含量大小依次为：浆膜>肠衣>肠粘膜，其中DS在浆膜中的百分含量最高，在肠粘膜和肠衣中的百分含量相近；DS在各部分的含量大小依次为：肠粘膜(0.95 g)>肠衣(0.42 g)>浆膜(0.30 g)。

(3)CS-C在肠粘膜中占15.81％，在浆膜中占11.61％，在肠衣中占13.61％。故，CS-C在各部分的百分含量大小依次为：肠粘膜>肠衣>浆膜，但相差不是很大；CS-C在各部分的含量大小依次为：肠粘膜(0.41 g)>肠衣(0.15 g)>浆膜(0.08 g)。

(4)CS-A在肠衣中占16.42％，质量为0.18 g，在肠粘膜、浆膜中均不含CS-A杂质。

综上，HP作为要分离的有效产物，在肠粘膜(1.22 g)、浆膜(0.29 g)、肠衣(0.34 g)中的含量比例为66.0∶15.6∶18.4，表明有效成分HP主要来源于肠粘膜；而有害物质OSCS在这三部分中均未发现。

3 结论

采用酶解法提取猪小肠肠粘膜、浆膜、肠衣中的粘多糖，并通过1HNMR对提取的粘多糖成分进行定性、定量分析。结果表明，肠粘膜的粘多糖主要成分为肝素钠，并含有硫酸皮肤素和硫酸软骨素C；浆膜中肝素钠和硫酸皮肤素的含量相当，并含有少量硫酸软骨素C；肠衣的粘多糖主要成分为硫酸皮肤素，并含有肝素钠、硫酸软骨素A及硫酸软骨素C；肠粘膜、浆膜、肠衣均不含多硫酸软骨素。

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