火炭母提取物抑菌活性的初步研究

欧阳蒲月，朱翠霞,陈功锡,邓玲芳

(1.广东食品药品职业学院，广东 广州 510520；2.吉首大学 植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首 416000;3.南药资源保护与利用工程技术开发中心，广东 广州 510520)

火炭母是蓼科(Polygonaceae)蓼属(Polygonum)植物火炭母(PolygonumchinenseLinn.)的药用全草,别名火炭毛、乌炭子、山荞毒草、赤地利、老鼠蔗等,是民间常用的中草药，广泛分布于我国南部的福建、广东、广西和贵州等地区，生长于水沟边、山谷、湿地上。性凉，味微酸、涩，有清热解毒、利湿止痒、明目退翳之效，临床上主要用于湿热泄泻、痢疾、黄疸、咽喉肿痛、湿热疮疹、霉菌性阴道炎等病症的治疗[1,2]。火炭母茎呈扁圆柱形,有分枝,长30～100 cm,节稍膨大,下部节上有须根;表面淡绿色或紫褐色,无毛,有细棱;质脆,易折断,断面灰黄色,多中空；托叶鞘呈筒状,膜质,先端偏斜[1]。已有人用 10％的火炭母滴眼液治疗角膜薄翳、角膜斑翳等眼疾[3]。火炭母中的药用成分主要为黄酮、生物碱、芳香杂环类化合物等[4]。研究发现火炭母对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和绿脓杆菌具有一定的体外抑菌活性[5]和体外抗肿瘤活性[6]，但其抑菌及抗肿瘤药效物质并不十分明确。

目前，对火炭母的生药学研究已经比较透彻,对其所含化学成分的研究也有一定进展。作者在此对火炭母提取物的抑菌活性进行研究，以期为提高火炭母的药用价值以及后续研究提供科学依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

火炭母地上部分采自湘西自治州吉首大学后山，由吉首大学陈功锡教授鉴定为火炭母。室温阴干，将叶与茎分离，65 ℃烘干，分别粉碎，过100目筛。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、痢疾杆菌(Shigelladysenteriae)、藤黄球菌(Micrococcusluteus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、白色念珠菌(Moniliaalbicans)，湖南省疾病预防控制中心。细菌在37 ℃培养24 h，以试管斜面培养基保存；真菌在29 ℃培养72 h，转接到培养皿中，保存，备用。

1.1.2 试剂

95％乙醇、无水甲醇、石油醚、乙醚、浓盐酸、硼酸、氨水、NaOH、琼脂、牛肉膏、蛋白胨，均为国产分析纯；黄连素，市售，四川亚宝光泰药业有限公司。

1.1.3 仪器

RE540 型旋转蒸发仪，Yamato；HM-205TOA型pH计；FD-1型冷冻干燥机；PW/10-002型培养箱；CCV-1311型超净工作台；SM-52型高压蒸汽灭菌器；AEG-220型分析天平；索氏提取器。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性物质的提取

1.2.1.1 不同部位提取物

取不同部位材料各5 g，分别加入65％、95％乙醇溶液100 mL，先超声提取30 min，然后45 ℃水浴30 min，趁热过滤，浓缩至5 mL，得不同部位提取物(生药浓度为1.0 g·mL-1)。

1.2.1.2 不同溶剂提取物

取1.2.1.1中抑菌效果最佳部位材料5 g，分别用蒸馏水、无水甲醇、65％乙醇、95％乙醇作溶剂，按1.2.1.1方法提取，得不同溶剂提取物。

1.2.1.3 不同提取方法提取物

超声提取物按1.2.1.1得到。

索氏提取物：取1.2.1.1中抑菌效果最佳部位材料5 g，装入索氏提取器的滤纸套筒中，加入100 mL 65％乙醇溶液，加沸石数粒，于80 ℃水浴加热回流提取5 h，提取液经旋转蒸发，定容至5 mL，即得。

1.2.1.4 不同溶剂萃取物

称取1.2.1.1中抑菌效果最佳部位材料50 g，加入最佳提取溶剂500 mL，按1.2.1.1方法提取，重复1次，合并滤液，浓缩至50 mL，使生药浓度为1.0 g·mL-1。滤液分别用石油醚、乙醚萃取(加萃取剂50 mL，混匀，静置30 min)，取上层液，下层液再用萃取剂重复萃取2次，合并萃取液，得到石油醚萃取物、乙醚萃取物，浓缩，以甲醇定容至50 mL，即得不同溶剂萃取物(生药浓度为1.0 g·mL-1)。

1.2.2 抑菌活性测定

1.2.2.1 对细菌的抑菌活性测定

(1)含药滤纸片的准备

用打孔器将定性滤纸打成直径为5 mm的小圆片，置培养皿内高压灭菌后，分别浸泡于不同供试药液中，备用。阴性对照浸泡无菌水，阳性对照浸泡黄连素溶液。

(2)接种

用竹签挑取细菌放入无菌水中成稀释菌液，用移液器吸取120 μL稀释菌液滴在直径为9 cm的营养琼脂平皿中央，用玻璃刮铲将菌液均匀地涂布于整个平皿，于培养箱内倒置培养10～15 min至培养基表面干燥后，分别将含药滤纸片均匀地放置在接种了不同受试菌的培养基表面(每皿放4片含药滤纸片)，稍加按压使之紧贴培养基。37 ℃培养24 h后，取出平皿，测量各纸片周围抑菌圈直径。

1.2.2.2 对真菌的抑菌活性测定

(1)含毒培养基的制备

在无菌条件下，取提取物5 mL、10 mL分别加入到25 mL 50 ℃左右的培养基中，充分振荡混匀后倒入直径9 cm的培养皿中。每浓度做2个重复，每种菌株抑菌实验重复2次。对照培养基为空白培养基，即不加任何提取物，只加相应体积的无菌水。

(2)接种培养

取培养基上生长5～7 d(菌丝均匀布满培养基表面)的供试菌种，用直径为5 mm的无菌玻璃管在菌落边缘切取带菌培养基(菌饼)，用接种针将菌饼分别接种至冷却后的含毒培养基和对照培养基中，每个平皿接种菌饼1块，置28 ℃的生化培养箱内培养3～4 d，待对照培养基中的菌丝体充分生长后(孢子不成熟)，测量处理组和对照组菌落直径(按十字交叉法测量菌落直径2次，取其平均值)，按下式计算抑菌率：

1.2.3 最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)的测定

取1.2.1中抑菌效果最佳提取物制成含生药浓度分别为4.0 g·mL-1、2.0 g·mL-1、1.0 g·mL-1、0.8 g·mL-1、0.6 g·mL-1、0.4 g·mL-1、0.2 g·mL-1、0.1 g·mL-1、0.05 g·mL-1的试液，取各浓度试液0.1 mL加入到0.8 mL的液体培养基中，接入0.1 mL菌悬液，摇匀，于37 ℃、200 r·min-1摇床培养24 h。若液体培养基完全清亮，表示无细菌生长，无细菌生长的最小生药浓度为最小抑菌浓度(MIC)。另设未加菌液为空白对照、黄连素为阳性对照。

从无细菌生长的液体培养基中取出0.1 mL涂布平板，于37 ℃培养24 h后，观察有无细菌生长。无细菌生长的最小生药浓度为最小杀菌浓度(MBC)。

2 结果与讨论

2.1 不同部位提取物的抑菌活性(表1)

由表1可知， 火炭母的叶与茎提取物均对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、 藤黄球菌有一定的抑制作用，其中叶提取物的抑制作用更强；火炭母对黑曲霉无抑制作用，但对白色念珠菌的抑制作用却很好，这可能是因为火炭母对黑曲霉和白色念珠菌的抑制作用机制不同而造成的。

表1 火炭母不同部位提取物的抑菌活性比较

2.2 不同溶剂提取物的抑菌活性

不同溶剂提取火炭母的叶粉末所得到的提取物的抑菌活性比较见表2。

表2 不同溶剂提取物的抑菌活性比较

由表2可知，65％乙醇提取物对各菌的抑制作用最强；无水甲醇提取物次之；95％乙醇提取物再次之；蒸馏水提取物最弱。由此推测：火炭母的抑菌活性物质可能具有表面活性，醇浓度太高或者用蒸馏水(不含醇类基团)都不利于其溶解释出。

各菌的敏感性由强到弱依次为：金黄色葡萄球菌>白色念珠菌>痢疾杆菌>藤黄球菌>枯草杆菌。这与李少基等[5]的研究结果相似。

2.3 不同提取方法提取物的抑菌活性(表3)

表3 不同提取方法提取物的抑菌活性比较

由表3可知，超声提取物对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、白色念珠菌的抑制作用较索氏提取物强；但对于枯草杆菌、藤黄球菌的抑制作用却相当，这说明超声提取和索氏提取对这两种菌的有效抑菌成分的提取效果相当。从整体来看，超声提取物抑菌效果较强，这与黄国霞等[7]的研究结果相似。这表明提取时间、溶剂浸泡时间可能对抑菌活性物质的提取没有多大影响；也有可能在索氏提取过程中提取出来了一些与抑菌活性物质相互影响的化学成分，影响了抑菌效果。

2.4 不同溶剂萃取物的抑菌活性(表4)

由表4可知，乙醚萃取物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、藤黄球菌、痢疾杆菌、白色念珠菌的抑制作用较强，远大于阳性对照黄连素；石油醚萃取物对以上5种菌也有一定的抑制作用；乙醚萃取物和石油醚萃取物对黑曲霉均无抑制作用；萃余物对各菌均无抑制作用。这些表明火炭母的抑菌活性物质易溶于非极性溶剂。乙醚对减弱抑菌活性的贡献最大，石油醚次之，这两种溶剂能够将抑菌活性物质萃取完全。因此，提取抑菌成分时，应选用这类非极性溶剂。

2.5 最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)(表5)

表4 不同溶剂萃取物的抑菌活性比较

由表5可知，火炭母提取物对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、 藤黄球菌、白色念珠菌的最小抑菌浓度(g·mL-1)分别为0.6、0.6、0.8、1.0、0.6；对5种菌的最小杀菌浓度均为1.0 g·mL-1。

表5 火炭母提取物的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

3 结论

对火炭母提取物的抑菌活性进行了研究。结果发现：(1)火炭母的抑菌活性物质存在于叶和茎中，但叶提取物的抑菌活性更高；(2)不同溶剂提取物中，65％乙醇提取物具有最高的抑菌活性；(3)超声提取物的抑菌效果较索氏提取物稍强；(4)提取物中的抑菌活性成分易溶于乙醚、石油醚等非极性溶剂；(5)火炭母提取物对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、藤黄球菌、白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为0.6 g·mL-1、0.6 g·mL-1、0.8 g·mL-1、1.0 g·mL-1、0.6 g·mL-1，最小杀菌浓度(MBC)均为1.0 g·mL-1。

参考文献：

[1] 国家中医药管理局.中华本草(第二卷)[M].上海：上海科学技术出版社，1999：647-649.

[2] 任国珍，何世东.火炭母复方为主治疗小儿急性细菌性痢疾52例[J].广西中医药，2001，24(1):32.

[3] 徐国钧，何宏贤．中国药材学(下册)[M]．北京：中国医药科技出版社，1996：1371.

[4] 谢贤强，吴萍，林立东，等.火炭母化学成分的研究[J].热带亚热带植物学报,2007，15(5)：450-454.

[5] 李少基，陈武，陈足金，等.12种中草药的体外抑菌试验[J].中兽医医药杂志，2004，(1):44.

[6] 韦金育，李延，韦涛，等.50种广西常用中草药、壮药抗肿廇作用的筛选研究[J].广西中医学院学报,2003，6(4):3-7.

[7] 黄国霞,刘柳,汪青,等.火炭母有效成分的提取及抗氧化活性研究[J].湖北农业科学，2001，50(12):2490-2492.