固定化酶技术在茶叶方面的研究与应用

段 莹 张灵枝

(华南农业大学茶业茶学系 广州 510642)

固定化酶是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物［1］。作为酶学研究的新领域，固定化酶因其显著的优点越来越受到重视，通过将这项生物技术与茶叶生产相结合，有利于充分发挥茶叶内含酶在茶叶生产与深加工方面的重要作用，改善茶叶品质，拓展茶叶的深加工领域和应用范围。

1 固定化酶技术的发展

固定化酶现象最早在1916年被 Nelson和Griffin发现，而直到1969年千烟一郎博士将其应用于工业，固定化酶才得以迅猛发展［2，3］。得益于固定化酶的稳定性高、易于控制、回收方便、可反复使用、成本低廉等优点，酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个重要研究方向，推动生物酶得到广泛而有效的利用，并开始在食品行业、生物工业、医学诊断与药品研究、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥重要作用［4］。

传统的酶固定化方法大致可分为4类:吸附法［5］、交联法［6］、包埋法［7］、共价结合法［8］。以上四种固定化酶方法各有其优缺点。随着生物技术的交叉发展，单一传统固定化方法暴露的缺点已明显限制了固定化酶技术的应用。因此在实际应用中，定向固定化酶技术以及多酶共固开始使用，尝试多种方法交叉使用，以提高固定化酶的活力，取长补短。Zuzana等［9］通过使用高碘酸钠活化半乳糖氧化酶糖链实现了对半乳糖氧化酶的定向固定，改善了催化动力学参数。苏二正等人［10］比较了海藻酸钠和壳聚糖两种载体及不同固定化方法对单宁酶和β-葡萄糖苷酶的共固定化效果，结果表明以海藻酸钠为载体，采用交联-包埋-交联固定化方法的效果最佳。

随着技术的进步，以降低成本，提高酶活性和稳定性，尽量减少或避免酶活力的损失为前提，新型载体酶固定化与无载体酶固定化技术开始受到广泛关注，并开展了大量研究。Kong等［11］以由海洋细菌Zoogloeasp.产生的细胞结合多糖(CBP)凝胶珠为载体固定葡糖淀粉酶。Serrano等［12］研究一类新型的无载体酶固定化技术——交联酶聚集体(CLEA)，将其用于氨基酰化酶的固定化，预期会显著提高酶活回收率，降低成本。

2 固定化酶技术在茶叶方面的研究

固定化酶技术在茶叶方面的应用起步较晚，始于20世纪60年代，最早应用于解决红茶“冷后浑”的问题。一项英国专利使用硅藻土固定单宁酶可以有效处理红茶“冷后浑”的问题［13－15］。而日本则是将单宁酶固定在聚砜中空纤维超滤膜上以此获得澄净的茶汤［16］。

其后的研究主要集中在茶叶重要酶类的固定化方面，包括多酚氧化酶、β-葡萄糖苷酶、过氧化物酶、单宁酶、果胶酶等。通过对茶叶重要酶类酶固定化方法的研究与探讨，寻求固定化技术的最优条件和最佳组合，从而实现酶的最大利用率，在茶叶深加工方向和检测领域发挥重要作用。

3 定化酶技术在茶叶方面的应用

3.1 茶饮料改进

速溶茶和茶饮料因其方便快捷的优点，在近几年内飞速发展并成为茶叶深加工的重要方向。但其冷溶性差、香气淡薄、易产生混浊、风味保存期短等问题一直难以得到有效解决，严重阻碍了茶饮料行业的发展。

针对这些问题，前人开展了广泛研究，发现单宁酶可以提高转溶率，去除混浊现象;果胶酶能提高萃取率，改善茶汤的清澈度。此外，纤维素酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、多酚氧化酶及过氧化物酶等对茶饮料品质也具有良好的改善作用。

吕连梅［17］研究发现，在茶饮料生产中添加固定化酶能有效改善茶饮料包括香气在内的品质，茶汤添加果胶酶的处理有效的改善了茶汤的感官风味:香气较高，滋味醇和。此外，经检测发现，果胶含量、茶汤的pH值降低，有可能延长保存期。

李平等［18］将固定化β-葡萄糖苷酶应用于茶饮料的增香，经气相色谱-质谱联用仪分析后发现香气的种类和总量均有所增加。苏二正［19］将单宁酶与β-葡萄糖苷酶共固定化应用于茶饮料的除混研究，试验显示，经共固定化酶处理后茶饮料中的酯型儿茶素有所降解，茶饮料的浊度非常稳定，茶乳酪的形成减少。

3.2 茶叶天然产物的生产

3.2.1 茶黄素生产 现代研究已经表明茶黄素具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗心脑血管疾病等多种功效且效果明显优于茶多酚，被广泛认定为茶叶生化成分利用潜力最大的物质之一。但是，从红茶中提取得率低、分离纯化困难、成本高，难于实现工厂化生产。因此，获取高含量的茶黄素已成为茶学、食品和医药研究的重要课题。

屠幼英等［20］探讨了固定化多酚氧化酶酶膜催化儿茶素生产茶黄素的最佳反应条件，并确定了酶膜法生产高纯度茶黄素的5个重要因素及最佳组合，试验获得茶黄素含量75.0%以上的高纯度茶黄素产品。

丁兆堂［21］用纳米碳酸钙固定多酚氧化酶，对茶多酚进行体外氧化制备茶黄素，结果表明，此法提取物含量较高、活性良好，具有工艺简单、易于分离等优点。陈晓敏［22］通过对比海藻酸钠和壳聚糖2种固定化材料，确定固定化酶的最佳参数为酶液与海藻酸钠比率1∶1、戊二醛浓度0.25%、cac12浓度2.0%，在pH在2.2～5.6的范围内茶黄素稳定性较高。

3.2.2 茶氨酸生产 Varuzhan H.Abelian等将Pseudomonas nitroreducens进行固定化，利用微生物酶连续将谷氨酰胺和乙胺转化成茶氨酸，并认为温度、pH、底物流速是影响茶氨酸合成效率的关键因素。

一项南京工业大学专利利用介孔TiO2材料多孔的独特结构，固定化γ-谷氨酰转肽酶为催化剂(MTOW-GGT)，一步法合成L-茶氨酸。其固定化酶是常规有机载体Eupergit C担载量的30倍。

3.3 农残检测测定

酶抑制法作为农药残留快速检测的重要手段，其检测用酶最为关键。植物酯酶因其来源广泛、价格低廉，成为酶抑制剂法测定农药残留的主要来源。但是其保存条件非常苛刻，一般要保存在－20℃，在0℃左右大部分已失活，使用受到一定的限制;通过酶固定化后可以有效改善不易保存的弊端，对农药的抑制效果也更加灵敏，便于保存与操作［23］。

许娟等［24］进行了硝酸纤维素膜(NC)固定植物酯酶的研究，建立了NC膜固定化植物酯酶的方法。与游离酶检测进行对比，固定化酶对所测农药敏感性都较高，更适合于农药的快速检测。此外，一项农药残留快速测定的国际专利将乙酰胆碱酯固定在一种特殊的、不与其活性部位发生反应的载体上面，既提高酶的稳定性，又排除杂质对酶活性的影响，提高灵敏度100倍以上，方便储存和保藏［25］。

3.4 酶传感器

酶生物传感器是由固定化的生物敏感膜和与之密切结合的换能系统组成，它把固化酶和电化学传感器结合在一起，兼具了固定化酶专一性、高选择性以及电化学高灵敏度的优点。在生物传感器领域中占有非常重要的地位。现阶段，通过酶固定化技术将酶膜与电、光、热等敏感的元件组成酶传感器用于茶叶内含成分的检测已有较多研究。

Chindilous［26］研究了茶叶中酚类物质定量的酶膜传感器制作方法，并将连接光导纤维的柱型酶传感器用于茶叶黄烷醇类的定量。日本学者堀江秀树［27］在氧电极顶部透氧性聚匹氟乙烯膜表面用丙烯树脂网固定L-氨基酸氧化酶，制成酶传感器，测定茶叶浸出液中的氨基酸浓度。此法对于高档茶叶中含量较多的茶氨酸和精氨酸响应较强，适合在茶叶品质评定上应用。

5 小结

酶具有反应条件温和，专一性强、反应效率高等特点，在茶叶深加工中有很大的应用。但是，目前的研究表明，通过酶的利用并没有彻底解决茶加工中存在的问题，如香气丧失、浑浊沉淀等。同时，酶本身在催化过程中易丧失，回收率很低，生产成本大。这些都阻碍了茶叶研究中酶的有效利用。

随着现代生物技术的发展以及酶工程自身的完善，酶工程与茶叶深加工结合得更加紧密。固定化酶技术作为酶学研究的新领域，其显著的应用优势在茶叶的深加工方向及应用领域发挥着重要作用。在茶叶生产中运用固定化酶技术对传统制茶工艺进行改善，可以有效解决茶叶深加工中提取率不高、茶汤易混浊等问题，提升提取效率，增加生产效益。在解决茶叶品质问题、开发茶叶新产品方面达到事半功倍的效果。

但在目前的固定化酶应用中，依然存在酶活不高，操作半衰期不够长，成本过高，不符合大工业生产的要求等问题。有理由相信，随着对酶学研究的深入，酶固定化研究将会取得新的进展和突破。固定化技术为酶的研究和应用提供了广阔的前景，同时，也为茶叶行业开辟了新的发展空间，注入新的活力［28］。

1 张树政.酶制剂工业［M］.科学出版社，1998，349.

2 肖海军，贺莜蓉.固定化酶及其应用研究进展.生物学通报，2001，36(7):9 －10.

3 杨玉铃.酶的固定化技术几载体材料研究新进展.粮油食品科技，2001，9(5):22－25.

4 Peter W C.Immobilized Enzymesin Analyticaland ClinicalChemistry Wiley［D］，New York，1980，6 －9.

5 Allal B，Jacques F，Jacques L，et al.Adsorption of succinylated lysozyme on hydroxyapatite.Journal of Colloid Interface Science，1997，189:37－42.

6 Quinn Z，Zhou K，Chen X D.Immobilization of β-galactosidase on graphite surface by glutaraldehyde.Journal of Food Engineering，2001，48(1):69－74.

7 Markvicheva，Elena A.Immobilized enzyme and cells in poly(N-vinyl caprolactam) based-hydrogels. Applied Biochemical Biotechnology，2000，88(1 －3):145 －157.

8 Yesim Y.Utilization ofbentonite asa supportmaterialfor immobilization of Candida rugosa lipase. Process Biochemistry，2005，40:2155－2159.

9 Zuzana B，Marcela S，Anton n L，et al.Oriented immobilization of galactose oxidase to bead and magnetic bead cellulose and poly(HEMA-co-EDMA) and magnetic poly (HEMA-co-EDMA)microspheres.Journal of Chromatography B，2002，770:25－34.

10 Atia K S.Co-immobilization of cyclohexanone monooxygenase and glucose-6-phosphatedehydrogenaseonto polyethylenimine-porous agarose polymeric composite using γ-irradiation to use in biotechnological processes.Radiation Physics and Chemistry，2005，73:91－99.

11 Kong J Y，Lee H W，Hong J W，et al.Utilization of a cell-bound polysaccharide produced by the marine bacterium Zoogloeasp.:new biomaterial for metal adsorption and enzyme immobilization.Journal of Marine Biotechnology，1998，6:99 －103.

12 Serrano PL L.Cao，Rantwijk FV，Sheldon RA.Cross-linked enzyme aggregates with enhanced activity:application to lipases.Biotechnology Letters，2002，24，(16).

13 曾晓雄，罗泽民.食品工业科技，1993，(5):24－27.

14 毛清黎，韩雅珊.食品科学，2001，22(3):12－16.

15 曾晓雄.茶叶通讯，1989(3):42－44.

16 Takino Yoshinori(CoCo-Cola Co)US，3959497(Cl.426 ～ 52;A23F3/00).1976-05-25.

17 吕连梅.固定化酶技术改善绿茶饮料香气品质的研究［D］.浙江大学，2004

18 李平等.丝素蛋白膜固定β-葡萄糖苷酶及其改良食品风味的研究.菌物学报，2004，23(1):73 －78.

19 苏二正.单宁酶、β-葡萄糖苷酶的共固定化及其在茶饮料加工中的应用研究［D］.安徽农业大学，2005.

20 屠幼英，方青，梁惠玲，黄海涛.固定化酶膜催化茶多酚形成茶黄素反应条件优选.茶叶科学，2004，(2).

21 丁兆堂.绿茶多酚纳米碳酸钙固定化酶定向转化及其产物的生物学活性研究［D］.山东农业大学，2005.

22 陈晓敏.茶黄素固定化酶生物合成及其稳定性研究［D］.浙江大学，2007.

23 Larosa C，Pariente F，Hernanddez L，et al.Amperometricflow-Through biosensor for the determination of pesticides.Anal Chim Acta，1995，308:129 －136.

24 许娟，李建科，牛乐.农药残留快速检测固定化酶片的研究.安徽农业科学，2008，(6).

25 陆贻通，周培，李振红.生物酶技术在农药残留快速检测中的应用进展.上海环境科学，2001，20(10):467－473.

26 Chindilis AL.Biosensors ＆ Bioelectrinics，1991，7:127.

27 堀江秀树，钟思强.用酶传感器测定茶叶浸出液中的氨基酸浓度.中国茶叶加工，1993(3):42－44.

28 时思全.固定化酶技术及其在茶叶中的应用.中国茶叶加工，2003，(2):31 －33.