苦参碱对喉鳞癌细胞株Hep-2侵袭转移的影响

李 圆，周雪华，刘亭彦，崔彩霞

苦参碱对喉鳞癌细胞株Hep-2侵袭转移的影响

李 圆，周雪华，刘亭彦，崔彩霞

目的：研究不同浓度苦参碱对喉鳞癌细胞株Hep-2侵袭和转移的影响及其作用机制。方法：Hep-2细胞体外培养，经0 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L和0.3 g/L苦参碱分别处理1 h、8 h及48 h，细胞黏附实验检测细胞黏附力，细胞迁移实验检测细胞运动力，细胞侵袭实验检测细胞侵袭力，RT-PCR法检测Hep-2细胞MMP-2和MMP-9 mRNA的表达。结果：不同浓度苦参碱与对照组比较，苦参碱能有效抑制Hep-2细胞的黏附力、运动力和侵袭力(P＜0.01)，且能下调Hep-2细胞MMP-2和MMP-9 mRNA的表达(P＜0.01)。结论：苦参碱能抑制Hep-2细胞的浸润转移能力，其机制可能与下调MMP-2和MMP-9 mRNA的表达使Hep-2细胞的黏附力、运动力和侵袭力下降有关。

苦参碱；Hep-2细胞；侵袭；转移；基质金属蛋白酶

喉癌是耳鼻咽喉科常见恶性肿瘤，发病率近年来有递增趋势。喉癌发生浸润转移，是影响生存质量和早期复发的主要原因[1]。苦参碱是从豆科植物苦参的干燥根中提取的主要生物碱之一，具有多方面的抗肿瘤活性[2]。有关苦参碱抑制喉鳞癌细胞株浸润转移的研究尚未见报道。本实验以喉鳞癌细胞株Hep-2为研究对象，观察不同浓度苦参碱对Hep-2细胞黏附力、运动力和侵袭力以及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的影响，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株 喉鳞癌细胞株Hep-2、小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3均由杭州师范大学中心实验室保存。

1.2 主要试剂 苦参碱（MW＝248.36，纯度99.6%，配制成10 g/L）由杭州师范大学生物化学教研室保存，人工重构基底膜（Matrigel胶，BD公司），纤维粘连蛋白（FN，Roche公司），聚碳酸酯微孔滤膜（Millicell小室，Millipore公司），Trizol reagent（Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（TaKaRa宝生物工程有限公司）。

1.3 细胞培养和分组 Hep-2细胞培养2 d后换液，长满瓶底80%后传代，取对数生长期的细胞用于实验。通过预实验，选择不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞，在细胞培养液中加入不同体积的苦参碱，使其终浓度分别为0 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L和0.3 g/L。以0 g/L为对照组，0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L分别为处理组1、2、3。

1.4 细胞生长曲线测定 调整Hep-2细胞密度为1×108/L，分别将200 μL细胞悬液接种于96孔培养板，每组每天各取5孔，细胞计数板计数，共做7 d，绘制细胞生长曲线。

1.5 细胞黏附实验 制备条件培养基：用RPMI 1640完全培养基在37℃、5%CO2培养箱内培养NIH3T3细胞，在细胞长势良好的情况下换无血清RPMI 1640培养基继续培养24 h，收集上清液，过滤除菌；用制备条件培养基配制含10 g/L BSA和1%优级胎牛血清的RPMI 1640培养液[3]，调整细胞密度为5×108/L，分别将200 μL细胞悬液接种于包被FN的96孔培养板。另设空白组，只加等量的培养液而不加细胞悬液和苦参碱。每组平行设5个复孔。培养1 h，弃上清，PBS冲洗除去未黏附细胞。弃PBS后加MTT液（5 g/L）20 μL/孔，孵育4 h。离心（1000 rmp）5 min，弃上清，加入DMSO 150 μL/孔，振荡2 min。酶标仪测各孔细胞490 nm处光吸收值（A值），间接计数黏附细胞数。以对照组A值为参照，按以下公式计算各组细胞黏附率：

黏附率＝〔（实验组A值－空白组A值）/（对照组A值－空白组A值）〕×100%

1.6 细胞迁移实验 培养液调整细胞密度为1×109/L，将Millicell小室放入24孔培养板，上室加入200 μL细胞悬液，下室加入条件培养液和含10%优级胎牛血清RPMI 1640培养液各200 μ。另设空白组，只加等量的培养液而不加细胞悬液和苦参碱。每组平行设5个复孔。培养8 h，取出Millicell小室，收集运动至下室的细胞。MTT法测A值间接计数运动穿膜细胞数。以对照组A值为参照，按以下公式计算各组细胞迁移率：

迁移率＝〔（实验组A值－空白组A值）/（对照组A值－空白组A值）〕×100%

1.7 肿瘤细胞体外侵袭实验 将包被Matrigel和FN的Millicell小室放入24孔培养板，上室培养液为含10 g/L BSA和1%优级胎牛血清RPMI 1640培养液，调整细胞密度为1×108/L，将200 μL细胞悬液接种到上室。下室加入条件培养液和含20%优级胎牛血清RPMI 1640培养液各200 μL，每组平行设5个复孔。培养48 h，取出Millicell小室，用棉签擦去微孔滤膜上层的细胞，固定、染色穿过微孔滤膜侵袭至下室的细胞，在400倍倒置显微镜下计数侵袭穿膜细胞数，每张膜选取10个视野。以对照组侵袭细胞数为参照，按以下公式计算各组细胞侵袭率：

侵袭率＝（实验组侵袭穿膜细胞数/对照组侵袭穿膜细胞数）×100%

1.8 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR） 调整细胞密度为1×108/L，各组分别作用Hep-2细胞48 h后，收集5×106个细胞，提取各组细胞的总RNA。实验步骤按其说明书进行，紫外分光光度仪和1%琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的质量。按RT-PCR试剂盒说明书进行逆转录和扩增，每组扩增30个循环，引 物 序 列 为 ：MMP-2（正 义 5̓-GGCCCTGTCACTCCTGAGAT-3̓，反 义 5̓-GGCATCCAGGTTATCGGGGA-3̓，退火温度58 ℃），MMP-9（正义5 ̓-CAACATCACCTATTGGATCC-3 ̓，反 义 5 ̓-CGGGTGTAGAGTTCTTCGCT-3̓，退火温度60℃），β-actin（正义5’-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3’，反义5’-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3’，退火温度，58℃），PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，采用凝胶成像扫描系统进行数据分析，以MMP-2或MMP-9 PCR产物光密度值与β-actin PCR产物光密度值的比值作为目的基因mRNA表达的相对值。以对照组目的基因mRNA表达的相对值为参照，按以下公式计算各组细胞MMP-2和MMP-9 mRNA表达率：

mRNA表达率＝（实验组mRNA相对值/对照组mRNA相对值）×100%

2 结果

2.1 苦参碱对Hep-2细胞药物浓度的选择及其增殖影响 经0.05 g/L、0.1 g/L、0.15 g/L、0.2 g/L、0.25 g/L和0.3 g/L苦参碱分别作用Hep-2细胞48 h，随着药物浓度的增加，苦参碱对Hep-2细胞增殖抑制作用逐渐增强，呈剂量依赖性，与对照组比较有显著性差异（F＝9.437，P＝0.000）。当0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L苦参碱分别作用Hep-2细胞48 h后，细胞生长抑制率依次为10.9%、16.7%、24.7%，表明低浓度苦参碱对Hep-2细胞48 h生长抑制率<30%，符合细胞黏附实验、细胞迁移实验和细胞侵袭实验的要求。详见表1。

2.2 苦参碱对Hep-2细胞黏附力的影响 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞1 h后，3个处理组黏附到FN上的细胞数受到不同程度的抑制，细胞黏附率随苦参碱浓度的增加而逐渐下降，抑制作用呈剂量依赖性。经统计学分析，处理组1、2、3的黏附细胞数明显少于对照组（P＜0.01），实验组1、2之间以及实验组2、3之间差别有统计学意义（P＜0.05），实验组1、3之间有显著性差异（P＜0.01），见表2。

表1 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞48 h的存活率(±s，n=5)

表1 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞48 h的存活率(±s，n=5)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与0.05 g/L比较，bP＜0.05；与0.1 g/L比较，cP＜0.05；与0.15 g/L比较，dP＜0.05；与0.2 g/L比较，eP＜0.05；与0.25 g/L比较，fP＜0.05

分组对照组0.05 g/L 0.1 g/L 0.15 g/L 0.2 g/L 0.25 g/L 0.3 g/L空白组OD值0.292±0.019 0.278±0.015 0.268±0.015 0.255±0.015 0.244±0.016 0.230±0.013 0.217±0.010 0.096±0.010细胞存活率（%）100 93.0±1.0a 88.2±0.9a、b 81.6±1.4a、b、c 74.9±2.1a、b、c、d 69.0±3.1a、b、c、d、e 61.7±3.0a、b、c、d、e、f

表2 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞1 h对细胞黏附力的影响(±s，n=5)

表2 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞1 h对细胞黏附力的影响(±s，n=5)

注：与对照组比较，aP＜0.01；与实验组1比较，bP＜0.05；与实验组1比较，cP＜0.01；与实验组2比较，dP＜0.05

对照组实验组1（0.1 g/L）实验组2（0.2 g/L）实验组3（0.3 g/L）空白组吸光度A值0.274±0.028 0.246±0.025 0.222±0.020 0.200±0.016 0.080±0.002黏附率（%）100 85.8±0.5a 73.5±2.0a、b 61.9±1.3a、c、d

2.3 苦参碱对Hep-2细胞运动力的影响 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞8 h后，3个处理组运动穿膜细胞数受到不同程度的抑制，细胞迁移率随苦参碱浓度的增加而逐渐下降，抑制作用呈剂量依赖性。经统计学分析，实验组1、2、3的运动穿膜细胞数明显少于对照组（P＜0.01），实验组1、2、3之间两两比较均有显著性差异（P＜0.01），见表3。

表3 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞8 h对细胞运动力的影响(±s，n=5)

表3 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞8 h对细胞运动力的影响(±s，n=5)

注：与对照组比较，aP＜0.01；与实验组1比较，bP＜0.01；与实验组2比较，cP＜0.01

对照组实验组1（0.1 g/L）实验组2（0.2 g/L）实验组3（0.3 g/L）空白组吸光度A值0.329±0.008 0.287±0.008a 0.256±0.008a、b 0.230±0.010a、b、c 0.080±0.001迁移率（%）100 82.9±1.1 70.9±0.6 60.1±2.5

2.4 苦参碱对Hep-2细胞侵袭力的影响 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞48 h后，3个处理组降解Matrigel胶侵袭穿膜的细胞数受到不同程度的抑制，细胞侵袭率随苦参碱浓度的增加而逐渐下降，抑制作用呈剂量依赖性。经统计学分析，处理组1、2、3侵袭穿膜细胞数明显少于对照组（P＜0.01），实验组1、2、3之间两两比较均有显著性差异（P＜0.01），见表4。

表4 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞48 h对细胞侵袭力的影响(±s，n=5)

表4 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞48 h对细胞侵袭力的影响(±s，n=5)

注：与对照组比较，aP＜0.01；与实验组1比较，bP＜0.01；与实验组2比较，cP＜0.01

对照组实验组1（0.1 g/L）实验组2（0.2 g/L）实验组3（0.3 g/L）侵袭细胞数（个）169±11 135±9a 108±9a、b 82±9a、b、c侵袭率（%）100 80.2±2.3 63.9±3.2 48.8±2.2

2.5 苦参碱对Hep-2细胞MMP-2和MMP-9 mRNA的影响 各组PCR产物电泳结果如图1所示，凝胶成像扫描系统计算各组MMP-2和MMP-9 mRNA的相对值。经统计学分析，3个处理组MMP-2和MMP-9 mRNA的表达均明显低于对照组（P＜0.01），实验组1、2、3之间MMP-2 mRNA的表达无差异（P＞0.05），实验组1与实验组2、3之间MMP-9 mRNA的表达有显著性差异（P＜0.01），而处理组2、3之间MMP-9 mRNA的表达无统计学差异（P＞0.05），见表5。

3 讨论

临床上最常采取的预防喉癌发生浸润转移的方法，是加大放疗剂量以及延长化疗疗程，这样不仅增加了化疗药物的毒副作用，也增加了患者的痛苦和经济负担[4]。因此，寻找有效的预防和治疗喉癌的药物，具有重要的意义和价值。有研究表明，苦参碱能抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化、促进肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤细胞多药耐药[2]。

苦参碱能抑制肿瘤细胞的增殖，且具有剂量依赖性。为了尽量减小苦参碱抑制增殖作用在细胞黏附实验、细胞迁移实验和细胞侵袭实验中的影响，本实验需要选择增殖抑制作用较小的苦参碱浓度。结果显示，当苦参碱浓度≤0.3 g/L时，作用48 h后其对Hep-2细胞的增殖抑制率<30%。因此，我们选择0.1 g/L、0.2 g/L和0.3 g/L苦参碱为本实验的药物作用浓度。

图1 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞48 h MMP-2和MMP-9 mRNA的表达

表5 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞48 h对MMP-2和MMP-9mRNA表达的影响(±s，n=5)

表5 不同浓度苦参碱作用Hep-2细胞48 h对MMP-2和MMP-9mRNA表达的影响(±s，n=5)

注：与对照组比较，aP＜0.01；与实验组1比较，bP＜0.01

对照组实验组1(0.1 g/L)实验组2(0.15 g/L)实验组3(0.2 g/L)MMP-2 MMP-2/β-actin 1.24±0.13 1.09±0.06a 1.08±0.06a 1.05±0.04a表达率(%)100 88.2±7.4 87.8±9.2 85.7±8.5 MMP-9 MMP-9/β-actin 0.97±0.05 0.76±0.03a 0.66±0.04a、b 0.64±0.04a、b表达率(%)100 78.3±3.4 67.8±6.4 66.3±4.4

在肿瘤细胞侵袭转移过程中，细胞外基质和基底膜是其侵袭转移的天然屏障。实验所用的Matrigel胶是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有人生理浓度的LN、FN和Ⅳ型胶原蛋白，与基底膜成分相似，常用来构建人工基底膜。本研究结果显示，0.1 g/L、0.2 g/L和0.3 g/L苦参碱不仅能抑制Hep-2细胞与FN的黏附力（P＜0.01），还能降低Hep-2细胞的运动力和降解Matrigel胶的侵袭力（P＜0.01），并且其抑制作用呈剂量依赖性。这一结果表明，苦参碱可以从黏附、运动和侵袭等多环节抑制Hep-2细胞的浸润转移能力，是一种较好的抗肿瘤侵袭转移的药物。

在肿瘤细胞侵袭过程中，MMPs结合肿瘤细胞后直接诱导宿主细胞产生更多MMPs，主要通过破坏肿瘤细胞周围的物理屏障、重塑细胞黏附力以便肿瘤细胞向周围生长、作用于基质成分后激发潜在的生物活性参与肿瘤的免疫过程及降解细胞外基质促进肿瘤血管的形成等机制来促进肿瘤侵袭和转移[5-6]。本研究检测了0.1 g/L、0.2 g/L和0.3 g/L苦参碱作用Hep-2细胞48 h后MMP-2和MMP-9 mRNA的表达。结果显示，0.1 g/L、0.2 g/L和0.3 g/L苦参碱能显著降低MMP-2和MMP-9 mRNA的表达（P＜0.01）。经相关性分析，Hep-2细胞MMP-2 mRNA的表达与细胞侵袭力成正相关，有统计学意义（r＝0.639，P＜0.05），MMP-9 mRNA的表达与Hep-2细胞侵袭力也成正相关，有显著的统计学意义（r＝0.961，P＜0.01）。提示苦参碱可能是通过下调MMP-2和MMP-9 mRNA的表达来抑制Hep-2细胞的侵袭力。然而，我们发现3个处理组MMP-2 mRNA的表达以及处理组2、3之间MMP-9 mRNA的表达均无统计学差异（P＞0.05），表明苦参碱对Hep-2细胞MMP-2和MMP-9的抑制作用不呈剂量依赖性。但是，苦参碱对Hep-2细胞侵袭力的抑制作用呈剂量依赖性，说明苦参碱可能还通过其他机制发挥抗侵袭转移的作用。此外，研究还发现，苦参碱对MMP-9的抑制作用较MMP-2强，这可能与MMP-2和MMP-9在侵袭转移中发挥的作用不同有关，具体机制有待更进一步的研究和证实。

[1]Marioni G,Marchese-Ragona R,Cartei G,et al.Current opinion in diagnosis and treatment of laryngeal carcinoma[J].Cancer Treat Rev,2006,32(7)：504-515.

[2]张鸣杰,黄建.苦参碱类抗肿瘤作用机制研究的新进展[J].中国中药杂志,2004,29(2)：115-118.

[3]司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].西安：世界图书出版公司，2004：216-228.

[4]Gold KA,Lee HY,Kim ES.Targeted therapies in squamous cell carcinoma of head and neck cancer[J].Cancer,2009,115(5)：922-935.

[5]Klein G，Vellenga E，Fraaije MW，et al.The possible role of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 in cancer，e.g.acute leuke⁃mia[J].Crit Rev OncolHematol,2004,50(2)：87-100.

[6]Sun Y，Dong LJ.Role of matrix metalloproteinases in the pathogene⁃sis and therapy of leukemia[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2003,11(3)：316-320.

Effects of Matrine on Invasion and Metastasis of Laryngeal Squamous Cell Carcinomas Cells Hep-2

Li Yuan，Zhou Xue-hua，Liu Ting-yan，et alDepartment of Otolaryngology，Affiliated Hospital of HangZhou Normal University，HangZhou（310015），China

ObjectiveTo study the inhibitory effects of Matrine on invasion and metastasis of laryngeal squamous cell carcinomas cells Hep-2.MethodsHep-2 cells were cultured in vitro and treated by 0 g/L,0.1 g/L,0.2 g/L and 0.3 g/L Matrine.Then cell adhesion assay,cell migration assay and cell invasion assay were used to observe the effects of Matrine on adhesion,migration and invasion of Hep-2 cells,and RT-PCR were performed to evaluate the MMP-2 and MMP-9 mRNA expression levels.ResultsContrasting to control group,0.1 g/L,0.2 g/L and 0.3 g/L Matrine not only could effectively inhibit the adhesion,migration and inva⁃sion of Hep-2 cells(P＜0.01),but also could down-regulate the expression of MMP-2 and MMP-9 mRNA(P＜0.01)ConclusionBy down-regulating the expressions of MMP-2 and MMP-9 mRNA,Matrine can inhibit the capability of adhesion,migration and invasion of Hep-2 cells.

Matrine；Hep-2 cells；Invasion；Metastasis；Matrix metalloproteinase

R285.5；Q95-33

A

1007-6948(2012)03-0261-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.03.013

浙江省自然科学基金资助(Y2090486，Y2100578);浙江省医药卫生科学研究基金资助(2009B130)

杭州师范大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科（杭州 310015）

李 圆，E-mail：liyuan81629@163.com

（收稿：2011-11-08 修回：2012-03-12）

（责任编辑 刘洪斌）