大肠癌虚证实证与CD44v6、PCNA表达的相关性研究

罗 明，李建明，陈海生,石传科，张学锋

大肠癌虚证实证与CD44v6、PCNA表达的相关性研究

罗 明，李建明，陈海生,石传科，张学锋

目的：通过检测细胞粘附分子(CD44v6)及增殖细胞核抗原（PCNA）在大肠癌不同中医证型中的表达，探讨CD44v6、PCNA与虚实证型的关系。方法：采用前瞻性组间对照的研究方法，筛选符合标准的大肠癌患者51例和大肠息肉患者17例，术前认真辨证，术后标本免疫组化检测各种证型组织中CD44v6及PCNA的表达。结果：息肉组织中CD44v6无表达或呈弱表达，大肠癌组织中CD44v6表达明显增强。大肠癌虚证与实证中有淋巴结转移或全身多处转移的患者，CD44v6的表达有显著差异性（P＜0.05），实证占85.7%，虚证占46.2%，而PCNA的表达无差异性（P＞0.05）。结论：CD44v6、PCNA在大肠癌中的表达具有较高的特异性。CD44v6作为细胞黏附蛋白分子，同肠癌的发生与发展可能有关，对大肠癌预后的判断具有重要的参考价值。PCNA在大肠癌进展期表达具有特征性意义。大肠癌实证中有淋巴结转移或全身多处转移的患者CD44v6的表达明显高于虚证中的表达，提示CD44v6及转移倾向与邪气的盛衰相关。

大肠癌；CD44v6；PCNA；中医证型；免疫组织化学

1 资料与方法

1.1 临床资料 本组中大肠癌51例，男25例，女26例；年龄24～87岁，中位年龄62岁。大肠息肉17例，男7例，女10例；年龄30～78岁，中位年龄60岁年。经卡方检验和t检验，两组资料基线特征无明显差异，具有可比性。

1.2 研究方法 采用前瞻性、单盲、对照的临床研究设计方案。对高度怀疑患有大肠疾病的患者，术前由进行严格辨证分型；经肠镜或手术取病理活检，由病理科采用S-P免疫组化分析。将大肠癌与大肠息肉患者CD44v6、PCNA的表达进行比较，确定其在大肠癌中有无特异性。对大肠癌各证型之间CD44v6、PCNA的表达进行组间比较对照。

1.3 观察项目 术前观察患者的主要症状及体征，舌苔脉象，通过望闻问切，四诊合参确定患者中医证型。⑴湿热蕴结：肛门坠胀，便次增多，大便带血，色暗红，或伴黏液，或有里急后重。舌质红，苔黄腻，脉滑数。⑵气阴两虚：面色无华，消瘦乏力，便溏，或排便困难，便中带血，色紫暗，肛门坠胀，或伴心烦口渴，潮热盗汗。舌质红或绛，少苔，脉细弱或细数。⑶气滞血瘀：肛周肿物隆起，触之坚硬如石，坠痛不休，或大便带血，色紫暗，里急后重排便困难。舌质紫暗，脉涩。

1.4 免疫组化分析 确定CD44v6、PCNA表达情况。CD44v6根据染色的程度和范围分为4级：强阳性(+++)：阳性细胞占整个切片的70%以上；阳性(++)：阳性细胞占整个切片的30%～70%；阳性(+)：阳性细胞占整个切片的10%～30%；阴性(-)：阳性细胞占整个切片的10%以下。PCNA根据染色的程度和范围分为3级：强阳性(+++)：阳性细胞占整个切片的70%以上；阳性(++)：阳性细胞占整个切片的30%～70%；阳性(+)：阳性细胞占整个切片的30%以下。

1.5 统计方法 采用SPSS11.5统计软件进行分析，计量资料以均值±标准差(±s)表示，采用t检验。计数资料采用χ2检验或确切概率法检验，以P＜0.05为显著性差异标准。

2 结果

2.1 CD44v6、PCNA表达 大肠癌患者中CD44v6、PCNA的表达均明显高于大肠息肉患者，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示CD44v6、PCNA在大肠癌中的表达具有较高的特异性。详见表1。

表1 大肠癌与大肠息肉患者中CD44v6、PCNA表达比较（n，%）

2.2 中医证型之间CD44v6、PCNA表达 结果表明，中医证型间CD44v6、PCNA表达比较，其差异无统计学意义，见表2。

表2 大肠癌各中医证型之间CD44v6、PCNA表达的比较（n，%）

2.3 大肠癌虚证与实证CD44v6、PCNA的表达 虚证指气阴两虚型，实证包括湿热内蕴型、气滞血瘀型。大肠癌虚证与实证中CD44v6、PCNA的表达比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。大肠癌虚证与实证中PCNA的表达比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表4。大肠癌虚证与实证中，有淋巴结转移或全身多处转移患者CD44v6的表达比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表3 大肠癌虚证与实证患者中CD44v6、PCNA表达的比较（n，%）

表4 大肠癌虚证与实证中有淋巴结转移或全身多处转移患者CD44v6表达的比较（n，%）

4 讨论

人的CD44基因位于第11号染色体短臂上，大小约60 kb，含有20个外显子。其中外显子6～15(即V1～V10)在转录过程中易于通过选择性剪接形成剪接变异体，即CD44v。CD44基因的表达产物CD44蛋白是一种跨膜糖蛋白，是黏附分子的一种，含胞质区、跨膜区及胞膜外区三个部分，其中胞膜外区由外显子1～16编码。CD44v则编码CD44蛋白的胞膜外部分的变异区，共含338个氨基酸[2]。CD44v的功能还不很清楚，但据推测，它可能通过细胞黏附和导向调节而在肿瘤的生长和转移中起作用。CD44v所编码的胞膜外区最近端的变化能改变细胞之间，细胞与基质之间的黏连，增加与透明质酸的亲合力，并改变肿瘤细胞的转移潜能[3]。CD44广泛分布于正常组织及恶性变组织。然而，恶性转化主要与CD44选择性剪接有关。而CD44v6与宿主组织基质细胞、细胞表面透明质酸及ECM的相互作用，刺激肿瘤细胞的增生、浸润及转移，所以CD44v6是目前判断癌肿转移、复发及预后的一项较好指标。Yamane等[4]对34例结直肠癌切除标本的检测结果发现，腺瘤中CD44v6检出率为100%，癌为91%，转移灶最弱(仅38%)，因此认为，CD44v6的表达是大肠癌的早期标志。CD44v6的增量表达可能在正常结肠黏膜恶性转化中发挥作用，其在腺瘤中的高表达可能使异常增殖的细胞“锚”在细胞外基质上。至于在癌和转移灶中的递减式低表达，则使癌细胞与透明质酸失黏附，从而获得浸润转移的能力。目前，关于CD44v与大肠癌转移的研究主要集中在CD44v6上。

PCNA是一种分子量为35KD的核内多肽，含261个氨基酸，其中酸性氨基酸明显多于碱性氨基酸，含6个外显子，内含子和外显子之间存在着大量重复序列，5段侧翼具有促进子的活性。在正常增殖细胞和转化细胞中，PCNA的量发生明显变化，大部分G0～G1期没有明显PCNA表达，G1晚期表达大幅度增加，S期达到高峰，G2～M期下降，其作为DNA聚合酶的辅助蛋白直接参与细胞增殖的DNA复制，而且与Cyclin、CDKs及p21形成四聚体调控细胞周期及细胞增殖[5]。PCNA是与细胞周期有关的蛋白，可作为细胞周期内S期的特异性标记，细胞增殖加快是癌细胞的基本特征，PCNA表达与细胞的增殖状态有关[6]。有实验发现，低分化腺癌、侵袭浆膜组的PCNA高于高分化腺癌、侵袭肌层组，提示随着肿瘤恶性程度增加及侵袭，肿瘤细胞增殖更为活跃，生长加速。PCNA与肿瘤微血管密切相关，当肿瘤未发生侵袭时，所需血供相对较少，细胞增殖能力有限；当肿瘤向间质浸润时，所需血供骤增，微血管增加，PCNA表达也明显增强，PCNA及肿瘤微血管生成共同促进了大肠癌的侵袭及转移。

在本研究中，大肠癌患者中CD44v6、PCNA的表达均明显高于大肠息肉患者，差异具有统计学意义（P＜0.05），其中大肠癌中CD44v6的表达高达74.5%，远高于大肠息肉患者中CD44v6的表达（42.2%）。大肠癌与大肠息肉患者中PCNA的表达均呈阳性表现，但PCNA的强阳性的表达大肠癌（45.1%）远高于大肠息肉（11.8%）。大肠癌组织中CD44v6和PCNA表达强度与患者的性别、年龄无相关性(P＞0.05)。大肠癌各中医证型中CD44v6和PCNA表达强度亦无统计学意义(P＞0.05)。但本研究者发现，大肠癌虚证与实证中有淋巴结转移或全身多处转移的患者CD44v6的表达有显著差异性（P＜0.05），实证占 12/14（85.7%），虚证占 6/13（46.2%），实证中的表达约是虚证的2倍。而PCNA的表达无差异性（P＞0.05）。以上结果提示，大肠癌患者中CD44v6、PCNA的表达均明显高于大肠息肉患者。大肠癌细胞膜中存在不同程度的CD44v6的异常表达，阳性率为74.5%，提示CD44v6作为细胞黏附蛋白分子，同肠癌的发生与发展可能有关，对大肠癌预后的判断具有重要的参考价值。增殖细胞核抗原PCNA在大肠癌与大肠息肉患者中的表达均呈阳性表达，但大肠癌中的强阳性表达更明显，充分体现了癌细胞的基本特征：细胞增殖加快。很明显，PCNA在大肠癌进展期有重要的意义。

《灵枢·百病始生》云：“正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚。”《素问·通评虚实论》说：“邪气盛则实，精气夺则虚”。虚实是辨别人体的正气强弱和病邪盛衰的两纲。虚证的形成，或因体质素弱（先天、后天不足），或因久病伤正，或因出血、失精、大汗，或因外邪侵袭损伤正气等原因而致“精气夺则虚”。实证的形成，或是由病人体质素壮，因外邪侵袭而暴病，或是因脏腑气血机能障碍引起体内的某些病理产物，如气滞血瘀、痰饮水湿凝聚、虫积、食滞等原因而致“邪气盛则实”。若从正邪双方力量对比来看，虚证虽是正气不足，而邪气也不盛；实证虽是邪气过盛，但正气尚未衰，是正邪相争剧烈的证候。此充分体现了中医的阴阳虚实理论，提示CD44v6及转移倾向与邪气的盛衰相关。

[1]吴孟超，吴在德.黄家驷外科学 [M].第7版，北京：人民卫生出版社，2008：1640-1641.

[2]Wheatley SC，Isacke CM，Crossley PH.Restricted expression of the hyaluronan receptor，CD44，during postimplantation mouse embryo⁃gen-esis suggests keyroles in tissue formation and patterning[J].Development，1993，119(2)：295-306.

[3]Sleeman J，Moll J，ShermanL，et al.The role of CD44 splice vari⁃ants in human metastatic cancer：Cell adhesion and human disease[M].Ciba Foundation Symposium 189，Wiley，1995：142-156.

[4]Yamane N，Tsujitani S，Makino M，et al.Soluble CD44 variant as a prognostic indicator in patients with colorectal cancer[J].Oncolo⁃gy，1999，56(3)：232-238.

[5]岳辉，张宁，冯新莉，等.胰腺癌组织中P57kip2、cyclinE和PCNA表达于临床病理因素的关系[J].癌症，2003,22(3)：705-709.

[6]成克伦，罗泊涛，杨宇明，等.甲状腺肿瘤细胞PCNA和Ki-67抗原表达及其相关性研究[J].中国医师杂志，2004，6(2)：193-195.

The Study on Expression of CD44V6、PCNA in Different Patterns of Colorectal Cancer in TCM Syn⁃ drome Differentiation

LUO ming,LI jian-ming,CHEN hai-sheng,et al.Department.of Zhongshan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhongshan（528400），China

ObjectiveTo explore the significance of CD44V6 and PCNA，and to reveal the essence as well as the gene relationship by detecting the expression of CD44V6 and PCNA in different patterns of colonrec⁃tal cancer on TCM syndrome differentiation. Method A prospective controlled study method was introduced.Fifty one colonrectal cancer patients and 17 patients with colonrectal polypus were divided into two groups rela⁃tively.The dialectical information was recorded preoperatively and all the colonrectal cancer patients had been pa⁃thology examinated postoperatively，CD44V6 and PCNA were immunohistochemically detected. Result CD44v6 was highly expressed in colorectal carcinoma，while in colonrectal polypus，the expression was not obvi⁃ous，with significant differences(P＜0.05).The PCNA was highly expressed in both colorectal carcinoma and poly⁃pus，the distribution was heterogeneous.The expression of CD44v6 in colonrectal cancer with positive lymph node and multiple metastasis was significantly different between excessive and deficient patterns（P＜0.05），the expression rate in excessive patterns was 85.7%，while in deficient patterns 46.2%，and the expression of PC⁃NA had no distinguish between the two groups.ConclusionThe expression of CD44v6 and PCNA in colorectalcarcinoma has a high specificity.CD44v6 may have correlation with the occurrenceand development of colorectal cancer，well as the prognosis.The expression of PCNA in colorectal carcinoma progression has a characteristic.The expression of CD44v6 in colonrectal cancer excessive patterns with positive lymph nodes and multiple metastasis is significantly higher than there in the deficiency patterns，which reflects deficiency-excess theory of TCM.CD44v6 is also related to transfer orientation and up and down of pathogenic qi in TCM syndrome diagnosis.

Colorectal cancer，CD44v6；PCNA；TCM syndrome type；Immunohistochemistry近年来随着人们生活水平的提高，大肠癌的发病率也在不断上升。2002年以后已超越胃癌跃居第二位，仅次于肺癌[1]。我们于2009年7月—2010年9月把细胞黏附分子(CD44v6)、增殖细胞核抗原（PCNA）引入中医辨证分型进行研究，通过检测CD44v6及PCNA在大肠癌不同中医证型的表达，探讨其与虚实证型的关系。

R735.3+4

A

1007-6948(2012)03-0234-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.03.005

2010年中山市科学技术局立项并资金资助项目（20102A095）

广东省中山市中医院(广州中医药大学附属中山市中医院)普外科（中山 528400）

（收稿：2011-06-10 修回：2012-04-12）

（责任编辑 孔 棣 屈振亮）