mTOR及其信号通路与视神经再生的关系

许益聘 综述 叶信海 审校

视神经损伤是眼外伤最严重的后果之一，在眼外伤中占较大的比例。急性视神经损伤在临床较为常见，如果缺乏及时有效的救治，半数患者最终将丧失视力[1]。视神经损伤后，视功能的恢复程度主要取决于视网膜节细胞（Retinal ganglion cells，RGCs）的存活数量和轴突的再生情况[2]。视神经损伤后的修复再生是一个复杂的生理生化过程，机制尚未明确。因此，如何最大限度地修复患者损伤的视神经，以期达到功能重建，提高患者的生存质量，对恢复患者正常的工作、生活具有重要意义。寻找促进视神经再生和修复的有效方法已成为现代神经生物领域的研究热点，研究发现mTOR信号通路的表达对视神经再生有重要作用。

1 mTOR的结构

雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）是1991年Heitman等[3]在分析雷帕霉素对不同酵母菌的作用时发现的，广泛存在于哺乳动物中，进化十分保守。人的mTOR基因位于染色体1p36.2上，其mRNA翻译后的蛋白质有2549个氨基酸残基，分子质量为289 KD。mTOR的结构域从氨基端到羧基端依次为HEAT重复序列、FAT结构域、FRB激酶结构域、NRD及FATC结构域。靠近mTOR的C端有一个激酶结构域，约234个氨基酸残基，其结构和磷脂酰肌醇3-激酶(PIKK)的催化域相似，是mTOR属于PIKK蛋白激酶类家族的重要原因之一。紧挨着激酶结构域上游的是FRB（FKBP12-rapamycin binding）结构域，它是 FKBP12-rapamycin复合物的结合位点，在雷帕霉素特异性抑制mTOR中起着连接作用。雷帕霉素可与细胞内的受体FKBP12结合形成FKBP-rapamycin复合物，再与mTOR的FRB区相结合，从而抑制mTOR的激酶活性[4]。

2 mTOR信号传导途径

2.1 上游信号传导途径

mTOR的上游信号传导主要通过PI3K/Akt/mTOR途径和非依赖PI3K/Akt途径，以实现对细胞生长、细胞周期等多种生理功能的调控。

2.1.1 经典信号传导途径—PI3K/Akt/mTOR信号通路

活化的磷酸肌醇 3激酶 （Phosphoinositide 3-kinases，PI3K）能磷酸化磷脂酰肌醇二磷酸盐（Phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate，PIP2）并转变为磷脂酰肌醇三磷酸盐（Phosphatidylinositol 3,4,5 trisphosphate，PIP3）。后两者仍然位于细胞膜，并召集下游分子Akt到细胞膜上。PIP3可以召集并激活磷脂酰肌醇依赖性激酶-1（Phosphatidylinositol-dependent kinase 1/2，PDK-1），从而使 Akt磷酸化并激活[5]。 另外，PTEN对 PI3K有反馈调节作用，催化PIP3转化为PIP2，从而负调节PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性[6]。因此，PTEN的失活能促使PIP2转化为PIP3，激活Akt和mTOR。

正常情况下，结节性脑硬化复合物-1（TSC-1）和TSC-2形成二聚体复合物，是小GTP酶Rheb（Rashomolog enriched in brain）的抑制剂，而Rheb是mTOR活化所必需的刺激蛋白，因此TSC-1/TSC-2在正常情况下抑制mTOR的功能。当Akt活化后，可磷酸化TSC-2而抑制TSC-1/TSC-2复合物的形成，从而解除了对Rheb的抑制作用，使得mTOR被激活[7]。

2.1.2 非依赖 PI3K/Akt途径

研究发现，AMPK（AMP-activated protein kinase A）与mTOR的活性调节有关。在哺乳动物细胞系中，氨基酸的代谢调节不是通过PI3K/Akt/mTOR通路来实现的，而是直接通过LKB1/AMPK/mTOR通路来调节。在细胞中，当ATP/ADP比率下降时，AMP的水平变化比ATP的变化更为敏感。AMPK则对细胞内非常细微的AMP浓度变化十分敏感[8]。在缺乏能量的细胞内，AMPK可以直接磷酸化并提高TSC-2的活性，促进TSC-1/TSC-2复合物形成，抑制Rheb酶活性，从而间接抑制mTOR通路的活性[9]。AMPK在能量压力下还可以直接磷酸化mTOR[10]。

2.2 下游效应器

真核细胞翻译启始因子4E结合蛋白（4E-BP）和p70核糖体S6蛋白激酶（p70S6K）是mTOR下游最具特色的两个效应器，形成了平行调节mRNA转译的两条信号通路。

4EBP1（eIF4E-binding protein 1）的 mRNA中含有从DNA中转录得到的遗传信息，是蛋白质生物合成的模板。在真核生物蛋白质合成的起始阶段，由于5’端mRNA的特殊帽状结构，核糖体不能直接与mRNA相结合，而是需要翻译起始因子的帮助。eIF-4E又称为帽结合蛋白（Cap-binding protein，CBP），它与mRNA的5’帽结构结合后再与eIF-4G结合，eIF-4G作为一种支架蛋白募集eIF-4A形成三聚体复合物eIF-4F，而此复合物可以使核糖体结合到mRNA上从而起始蛋白质的翻译。4EBP1有同eIF-4G相似的eIF-4E识别序列，故4EBP1、eIF-4G与eIF-4E的结合存在部分重叠，4EBP1可以通过竞争性抑制eIF-4G与eIF-4E的结合来达到抑制翻译起始的作用。mTOR信号通路通过磷酸化4EBP1，使eIF-4E与其解离并活化，促使翻译起始复合物的形成，从而加速蛋白质的合成。相反，当生长因子或营养素缺乏，或者有mTOR抑制物存在时，4EBP1去磷酸化，并与eIF-4E结合从而抑制翻译起始[11]。

p70S6K是核糖体40S小亚基S6蛋白激酶，可激活S6；而 S6可以提高含 5’-TOR（5'-terminal oligopyrimidine tract）的一类mRNA的翻译效率。这类5’-TOR mRNA约占总mRNA的20%，它的翻译产物包括许多翻译元件成分如核糖体蛋白、延伸因子EF1ɑ等。mTOR可以磷酸化并激活S6K1，使核糖体40S小亚基易于结合翻译复合物，并提高5’-TOR mRNA的翻译效率[12]。

3 mTOR信号通路与视神经再生的关系

成年哺乳动物的中枢神经系统损伤后，神经元不会再生。这是因为中枢神经细胞外环境中的抑制因子和成熟CNS再生能力的减弱[13-16]。随着细胞外抑制因子的清除，损伤部位周围只能出现一定量的轴突再生[17-19]。而细胞内在的再生能力对轴突再生起着决定性作用。在哺乳动物发育期过后，大部分的成熟神经细胞常表达一些抑制细胞生长的因子[20]。有研究通过向成年小鼠玻璃体腔内注射表达腺病毒的方法敲除特异性基因，来观察细胞因子对视神经再生的影响，其中包括 Rb、P53[21]、Smad4[22]、Dicer[23]、LKB1[24]和 PTEN[25]。 在注射病毒2周后，制造视神经挤压伤，观察损伤后视网膜节细胞（Retinal ganglion neurons，RGCs）存活数目及轴突再生情况。结果显示，PTEN的敲除能使RGCs存活数目增多，并且在损伤14 d后能观察到RGCs轴突纤维有较长距离的再生。损伤2周后敲除PTEN的RGCs的存活数目为45%，与对照组的20%相比有明显增多。8%～10%RGCs的轴突向损伤中心生长长度超过了0.5 mm，部分甚至超过3 mm。这些再生神经纤维能沿着视神经继续生长，在损伤4周后能延伸到视交叉。在其他敲除基因中，只有p53的敲除能诱导增加RGCs存活数目，但并没有出现轴突纤维再生。从而可以看出RGCs的存活数目的增多并不一定会同时出现视神经再生[26]。

PTEN的敲除能激活PI3k/mTOR信号通路，然后该信号通路通过调节蛋白质的合成从而控制细胞的生长和大小。mTOR的下游传导途径主要为核糖体S6激酶1(S6K1)和4EBP1。S6K1的功能是磷酸化核糖体蛋白S6(p-S6)，故可以利用p-S6的抗体来监测mTOR信号通路活化。在胚胎时期的神经元细胞中可观察到高水平表达的p-S6，但在90%的成熟RGCs中p-S6表达明显减少。这证明大部分成熟RGCs的mTOR信号通路是处于失活状态的，只有少部分RGCs保留着mTOR通路的活化。然而当视神经轴突断裂损伤后，RGCs的p-S6完全被抑制，表明视神经损伤可进一步抑制mTOR通路的激活。这不仅仅与损伤直接相关，也与损伤后的缺氧状态及Redd1/2信号的上调等因素相关[26-29]。

成年小鼠在PTEN基因敲除的诱导作用下，视神经RGCs的p-S6表达水平未见提高，然而遭受视神经挤压损伤后可观察到与未损伤时相接近的p-S6表达水平。尽管轴突经历了损伤的应激反应，敲除PTEN的神经元仍能保持与未损伤时相接近的mTOR激活比例，并且出现轴突再生的RGCs数目比例与未损伤时相接近。

在PTEN敲除诱导成熟RGCs轴突再生作用中，mTOR通路的活化也是非常必要的。通过抑制mTOR通路的激活来观察轴突再生情况的实验显示，随着mTOR的抑制剂雷帕霉素的应用，RGCs内的p-S6水平明显降低，抵消了神经元的存活数目增多及轴突再生，证明了mTOR在敲除PTEN后出现的视神经再生中起到关键作用。但仍能观察到少量的轴突再生纤维，这可能与PTEN的其他下游传导途径相关。

mTOR的另一个负调节通道TSC1/2能抑制mTOR的激活，但TSC1或TSC2中任一个缺失都将导致mTOR通路的激活[30-32]。在敲除TSC1的成年RGCs遭受视神经损伤后，RGCs的p-S6水平提高，并且RGC存活数目明显增多。最重要的是，敲除TSC1的视神经中观察到相应的轴突再生，但轴突的再生程度比起敲除PTEN所诱导的要弱一些。而对照组未见到轴突再生。因此，mTOR信号通路能有效地促进RGCs的存活及轴突再生。

综上所述，mTOR信号通路及所调控的蛋白质翻译在视神经损伤后的轴突再生中起到重要作用。在成熟神经元损伤后，mTOR信号通路处于失活状态，并抑制了轴突再生所需蛋白质的合成。通过敲除PTEN或TSC1基因的方法可诱导轴突再生所需的蛋白质合成，从而促进RGCs轴突再生。但现有的研究尚处于初步阶段，其具体的信号转导调节机制及与视神经再生发生机制更详细的关系还有待深入研究。

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