新一代组织工程细胞支架的研究进展

李志义 丁兆红 刘志军

新一代组织工程细胞支架的研究进展

李志义 丁兆红 刘志军

细胞支架是构建组织工程器官或组织的重要基础。在短短几十年内，细胞支架的研究与开发已取得了重大进展，促进了细胞支架从第一、二代向第三代发展。本文概述了第三代细胞支架的主要特征；介绍了细胞支架制备技术的最新进展，特别介绍了用超临界反溶剂（SAS）工艺制备第三代细胞支架的特点、优势及技术关键；指出了开发第三代细胞支架的重要途径之一：利用SAS工艺将天然、合成高分子材料与生物活性材料这三类材料进行复合，制备性能可调、综合性能优良的细胞支架；并提出了按此途径尚需开展的主要研究内容和要达到的主要目标。

组织工程细胞支架超临界反溶剂工艺

1987年，组织工程的先驱，哈佛医学院外科医师Joseph Vacanti和MIT生物医学工程师Robert Langer在华盛顿召开的美国自然科学安全会议上首次系统地描述了组织工程的概念[1-2]，并将组织工程定义为：应用工程和生命科学原理来开发生物替代品，用以修复、维持和改进组织或器官功能[3]。随着生物医学工程的发展以及细胞治疗的出现，组织工程得到了迅速发展，已成为再生医学的一个分支。

尽管组织工程在临床应用上还面临诸多挑战[4]，但在骨、软骨、血管、皮肤等方面的研究已取得了重大进展，而且骨和皮肤组织工程已开始临床应用研究[5]。随着组织工程产品进入市场和临床试验，所用生物材料的销售额已超过了2.4亿美元/年[6]。

细胞支架、种子细胞和生长因子（或生物反应器）是组织工程的三大要素[7]。其中，细胞支架是基础。它为种子细胞和生长因子提供了适宜的微环境，完成组织或器官的再生过程。因此，细胞支架，特别是三维细胞支架的研究一直是组织工程的热点[5]。本文对组织工程细胞支架的研究开发新趋势及新途径作一简介。

1 新一代组织工程细胞支架的特征

细胞支架用生物材料经历了第一代与第二代发展[8-9]。第一代是生物“惰性”材料。其特征是具有良好的物理性能（强度和耐腐蚀性等），植入体内后排异反应较小[10]。可供临床使用的典型生物惰性材料是金属（贵金属和合金等），但其主要缺点是，因其刚性与强度与被替代组织差异很大，植入体内后会因应力遮挡导致界面附近组织萎缩[11]。

第二代细胞支架用生物材料是生物“活性”或生物可吸收材料[12]。其特征是，能在生理环境中产生一系列表面反应和生物响应[13]，故具有骨传导、骨诱导和骨生成作用[7]。典型的生物活性材料是生物活性玻璃和玻璃陶瓷[11]。它们都能与骨骼形成骨键结合，主要由Na2O-CaO-MgO-P2O5-SiO2体系组成，与骨骼形成骨键结合的速度主要取决于各个组分[14]。羟基磷灰石（HA）是人体骨的矿物相，具有良好的生物活性和骨传导性，因而在骨细胞支架制备中得到了广泛关注[15]。然而，近来的研究表明，生物活性玻璃（代号为45S5）作为骨细胞支架在促进新骨和血管形成等方面更为优越[16-17]。

生物活性玻璃植入人体内后会发生如下表面反应和细胞活动[18]：第1、2步，形成SiOH键并释放Si(OH)4；第3步，形成水合二氧化硅层；第4步，形成无定形Ca+PO2+CO3层；第5步，形成羟基磷灰石（HA）层；第6步，生长因子在HA层吸附；第7步，巨噬细胞作用；第8步，成骨细胞附着；第9步，成骨细胞繁殖与分化；第10步，细胞间质基质产生；第11步，细胞间质基质矿化生成新骨。前5步表面反应进行得非常迅速，在24 h内就能完成[13]。表面反应大大强化了骨的键合与形成作用。研究表明，这种强化作用与调节诱发细胞周期开始和进程的基因直接相关[11]。骨前细胞周期调控的结果，使成骨细胞快速繁殖和分裂，从而导致骨的迅速再生[19-20]。生物活性玻璃已在临床得到应用，对其应用前景，Hench等[8]认为，如果能用玻璃激活基因，可以肯定，将来就能用它控制基因，使组织始终保持健康状态。

典型的生物可吸收材料是生物可降解的高分子聚合物，分天然的和合成的两大类。可用于细胞支架的天然高分子材料有3类[21]：多聚糖类、蛋白类和微生物来源聚脂类。多聚糖类包括壳聚糖、透明胶质酸、藻酸盐类、淀粉、细胞膜质、右旋糖酐等；蛋白类包括胶原蛋白、丝素蛋白、纤维蛋白凝胶等；微生物来源聚脂类包括聚羟基脂肪酸脂、聚3-羟基丁酸脂和聚4-羟基丁酸脂等。天然高聚物具有可降解性，且毒性低、来源丰富。但也存在一些缺点：溶解或降解太快、生物性能不稳定、免疫排斥及传染疾病等。

壳聚糖是自然界中唯一的阳性线性多糖，无毒、无刺激性。由于是弱碱性，与人体相容性良好，且具有较好的生物降解性和灭菌作用。壳聚糖具有亲水性表面，有利于细胞的附着、繁殖与分化。但其力学性能和稳定性差，不容易保持预定形态[22]。

淀粉是一种可再生的天然高分子材料，其分子式为(C6H10O5)n，具有独特的化学和物理性能以及营养功能。淀粉及其水解产品是人类膳食中可消化的碳水化合物。由于它可生物降解、稳定性和生物相容性好、安全、无毒，并具有独特的生物功能性等，在生物医学领域具有广阔的应用前景[23]，在骨细胞支架制备中也受到广泛重视[5]。

可用于细胞支架材料的合成生物可降解聚合物有聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）、聚乙醇乙酸（PGA）、PLA与PGA的聚合物（PLGA）、聚羟基丁酸戊酸脂（PHBV）、聚胺基甲酸脂（PU）等。PLA有聚左旋乳酸（PLLA）、聚右旋乳酸（PDLA）和聚消旋乳酸（PDLLA）3种构型。PDLA为非晶态，机械强度较差，一般不用作细胞支架材料。除它之外的上述合成生物可降解聚合物都具有较好的机械强度、生物降解性和生物相容性，但它们亲水性较差，细胞黏附力弱，不利于细胞的附着与生长[5]。

为改善天然和合成高分子聚合物单独用于细胞支架时的亲水性、降解性、稳定性、力学性能以及细胞相容性等，将两种材料复合使用可以达到良好效果。例如，将淀粉与PCL复合[24-25]、与PLA复合[26-27]、与聚乙烯醇复合[28-29]等，将壳聚糖与PLA复合[30-32]、与PCL复合[33-35]、与PLGA复合[36]等。这些复合材料，不仅可以改善细胞支架性能，而且还可以通过调节复合材料的比例，有目的地调控细胞支架性能。

第二代细胞支架用生物材料的缺点是，具有生物活性的材料，缺乏生物可吸收性；而具有生物可吸收性的材料，则不具备生物活性[8]。

新一代（第三代）细胞支架用生物材料是既具有生物活性又具有生物可吸收性的材料[8]。其特征是，具有与新组织生成速度相匹配的被吸收速度，同时能在分子生物学水平上对细胞或基团的作用进行调控。开发新一代细胞支架用生物材料的基本途径是，在第二代生物材料的基础上，使生物可吸收的材料具有生物活性，或者使具有生物活性的材料具有生物可吸收性。

进入21世纪以来，人们将研究重点移至开发新一代细胞支架等材料上，基本途径是以生物可吸收的材料为基体，通过复合或表面修饰的方式对生物活性材料进行改性。例如，You等[37]、Salerna等[38]和Raussi等[39]分别用溶胶—凝胶、超临界流体发泡和湿化学法制得了PCL/HA复合支架，Jack等[40]用热诱导相分离法制得了PHBV/HA复合支架，EI-Kady等[41]和Hong等[42]分别用冷冻萃取法和热诱导相分离法制得了PLLA/45S5复合支架，Yun等[43]用溶胶—凝胶与气化诱导自组装相结合的方法制得了PCL/45S5复合支架，Chen等[44]用盐粒子沥滤法制得了PDLLA/HA复合支架，Helen等[45]用热诱导相分离法制得了PDLLA/45S5复合支架，Rszkowska等[46]用盐粒子沥滤法制得了PV/45S5复合支架。Rezwan等[47]对复合支架研究进展进行综述，讨论的生物可降解材料主要有PDLLA、PLLA、PCL、PGL和PHBV等，涉及的生物活性材料主要有生物活性玻璃、玻璃陶瓷以及羟基磷灰石等，涉及的制备方法主要有热诱导相分离法、盐粒子沥滤法、微球烧结法和固体自由成型技术等。

2 组织工程细胞支架制备新技术

除了上述的溶胶—凝胶法、气体发泡法、湿化学法、热诱导相分离法、冷冻萃取法、气化诱导自组装法、盐粒子沥滤法、微球烧结法和固体自由成型法等外，目前用来制备细胞支架的方法还有熔融成型法、纤维黏结法、电纺丝法等，以及在这些方法的基础上发展的一些复合技术（例如相分离/粒子沥滤、粒子沥滤/冷冻干燥、电纺丝/粒子沥滤/气体发泡工艺等）和新型快速成型工艺等[5，47]。

尽管这些方法各有特点和优越性，但有些问题仍然是制约其应用的关键。例如，这些方法大都涉及有机溶剂，再对其进行脱除，而残留有机溶剂达到临床应用可接受的范围就成为一个难题；有些方法涉及高温，不利于制备过程中生物活性物质的引入；有些方法形成的孔隙率低，孔与孔之间相互贯通差；有些方法无法实现对孔径的控制，孔结构及其强度较差；有些方法工艺复杂，在实验室完成一个制备过程需很长时间（例如浇铸/粒子沥滤工艺需要7 d）等。

将超临界流体引入组织工程细胞支架的制备，已经引起了较多关注[48]。目前已在两个方面取得了可喜进展，一是将超临界二氧化碳（ScCO2）引入现有的细胞支架制备工艺，利用ScCO2对有机溶剂超强的溶解力，将制备过程中残留的有机溶剂萃取掉[49-50]；二是在超临界流体技术的基础上发展形成的ScCO2发泡工艺[51-53]。将ScCO2引入现有的制备工艺，能够有效地除掉残留的有机溶剂，但增加了原工艺的复杂性。ScCO2发泡工艺形成的孔径大小不一，孔隙率较小，易形成闭合孔[48]。研究表明，这与聚合物的玻璃化转变温度Tg直接相关[54-55]。渗入了ScCO2的聚合物在迅速降压过程中，如果其玻璃化转变温度Tg升高（例如结晶性聚合物），所形成的空泡就会闭合，无法形成相连通的孔。或者出现并泡现象，形成一些大泡孔，导致部分结构破坏。因此，ScCO2发泡工艺尚不适用于结晶性聚合物。

超临界反溶剂（Supercritical Anti-Solvent，简称SAS）工艺本来是为制备纳米/微米超细微粒而开发的一种先进的超临界流体工艺，但用它来制备多孔结构也十分有效。在制备醋酸纤维素超细微粒研究时发现，当醋酸纤维素溶液（溶剂为丙酮）浓度为8%时，得到的是平均粒径为2.8μm的醋酸纤维素球形微粒。如果将溶液浓度提高到20%（W/W）时，会形成平均孔径为25μm的多孔结构。

后续的研究表明，用SAS工艺制备组织工程细胞支架优势突出[57]。对该工艺过程中的相平衡热力学和扩散动力学进行深入研究后揭示了多孔结构的形成机理。用SAS工艺制备高分子聚合物多孔结构具如下特点[57]：①由于ScCO2具有超强的溶解能力和渗透性，它不仅可将溶液中的有机溶剂“萃取”出来（促使发生液―液相分离后，将有机溶剂完全溶解），而且可渗透到高分子聚合物相，将残留在聚合物中的有机溶剂萃取出来，从而得到纯度很高的细胞支架。②ScCO2不仅具有“萃取”作用，而且会对所形成的多孔结构起到“干燥”作用。由于超临界流体的特殊性能（可连续地进入气相或液相状态，不发生相变），ScCO2对所形成的多孔结构的“干燥”过程不产生气—液界面，因而不会产生过大的表面张力，这就彻底解决了现有工艺干燥过程的结构塌陷问题。③因ScCO2价廉、无毒、不燃烧、不污染环境，而且能使SAS过程在接近常温（其临界点只有31℃）下进行，这为热敏性（如生物活性材料）引入细胞支架提供了一条有效途径。④通过简单的减压就可以使有机溶剂和反溶剂分离，且溶剂与反溶剂均可循环使用；工艺流程简单，可实现“一步法”操作。⑤控制操作条件（压力、温度、浓度等），可以控制所形成细胞支架孔的结构与形态，实现对产品结构的预设计与制造控制。

研究已经揭示了SAS工艺形成多孔结构的机理[58]，这可借助于三元相平衡图（图1）来说明。图中双结点线代表着液—液分层的边界，在双结点线以外（靠近聚合物和溶剂顶点侧）为均相区，在双结点线以内，为非均相区。由双结点线与旋节线将非均相区划分为三个区，在临界点（双结点线与旋节线的交点）以上和以下由双结点线与旋节线组成的两个亚稳定区和以旋节线为边界的非稳定区。图1表示的是“PMMA/DMSD/ScCO2”三元体系，图中3条带箭头的线代表了三种传质路径，1、2、3三条路径在某一点初始浓度分别为25%（W/W）、10%（W/W）和5%（W/W）。多孔结构形成过程在压力为20MPa、温度为35℃下进行。第1条传质路径是在临界点以上跨越双结点线进入液—液分层的亚稳定区，此时液滴的成核与长大是在PMMA贫含相进行的，因此PMMA固化后成为连续相，而微孔成为分散相，即形成了多孔结构。第3条传质路径是在临界点以下跨越双结点线进入液—液分层的亚稳定区，此时液滴的成核与长大是在PMMA富含相进行，因此PMMA固化后成为分散相，微孔成为连续相，即形成了分散微粒。第2条传质路径是在临界点附近，同时跨越双结点线和旋节线进入非稳定液－液分层的亚稳定区，此时液滴的成核与长大同时在PMMA贫含区和富含区进行，因此可得到微孔和微粒共存的过渡结构。

图1 聚合物/溶剂/超临界CO2三元体系相图Fig.1 Polymer/solvent/supercritical CO2ternary system diagram

3 组织工程细胞支架的研究开发新途径

从研究内容上看，第二代细胞支架的研究重点是探索发展生物活性和生物可吸收细胞支架的各种途径，从而开发了许多支架材料和制备方法。进入21世纪后，新一代（第三代）细胞支架的开发研究受到关注，研究内容基本上集中在探索将生物活性和生物可吸收两种材料进行复合的方式和效果。总体上讲，属于可行性研究。所有这些研究结果，还不能对细胞支架进行“设计”。也就是说，目前的研究只限于在某种条件下会产生什么结果，但未涉及某种结果是由什么条件产生这样的问题。解决了这一问题，就可以对细胞支架进行设计。

要解决细胞支架的设计问题，就要建立细胞支架制备条件与其性能之间的关系。要确定这样的关系，就要开展细胞支架的综合性能研究。

就三维多孔骨细胞支架而言，其综合性能主要包括3方面：结构性能、力学性能和生物性能。结构性能主要包括细胞支架的几何特性（支架的孔径及其孔隙率）和复合材料在支架中的结构形态，力学性能主要包括细胞支架的强度和刚性，生物性能主要包括细胞支架的降解性和生物活性。

研究开发新一代复合骨细胞支架的途径之一是：利用三类材料进行复合，第一类是合成生物可降解高分子材料，第二类是天然生物可降解高分子材料，第三类是生物活性材料。第一类材料如聚乳酸（PLA）和聚己内脂（PCL），第二类材料如淀粉和壳聚糖，第三类材料如生物活性玻璃（45S5）和羟基磷灰石（HA）等。第一类材料是细胞支架的主体材料。复合第二类材料的目的是改善复合支架的亲水性，调节复合支架的降解速率和强度、刚性，使其满足特定需要。例如，支架的降解速率要与新骨的生成速率相匹配，支架的强度和刚度要与原骨的强度和刚度相近。复合第三类材料的目的是使细胞支架具有生物活性。

利用超临界CO2反溶剂（SAS）工艺制备上述复合细胞支架。SAS工艺除了具备前述的5方面的特点外，还能使复合过程一次完成，更主要的是能够控制三类复合材料在形成的复合细胞支架中的结构形态。为了使复合细胞支架具备更强的力学性能和生物性能，希望在形成的复合细胞支架中，第一类和第二类材料均匀混合形成细胞支架主体，第三类材料以微粒（纳米或微米级）的形态黏附在支架主体内孔的内壁上。研究表明，当生物活性成分以纳米或微米微粒的形态分布在支架内孔的内壁面时，相对被包覆在支架主体结构内而言，其可溶性离子的释放速率、生长因子的吸附、成骨细胞的附着以及基质体的矿化程度等都会大幅提高。这是因为，纳米或微米微粒具有更大的表面积，它黏附在支架内孔的内壁面时，更加有利于表面反应的快速进行[13]。

三类材料在用SAS工艺制备的复合材料细胞支架中的结构形态是由体系的相平衡和传质规律决定的[59]。ScCO2与每一类材料以及所选用的溶剂都存在如图1所示的三元相平衡图[60]。尽管每一体系由于其他两个体系的存在，使其相平衡及传质行为变得更加复杂，但仍然可以借此三元相平衡图来定性地说明每一类材料在复合支架中的结构形态。也就是说，要保证第一类和第二类材料在复合支架中以连续相的形态形成支架主体，它们在各自的三元相图中的传质路径是，在临界点以上跨越双结点线进入液—液分层的亚稳定区。要保证第三类材料在复合支架中以分散相的形态（微粒）黏附在支架主体内孔内壁，其三元相图上的传质路径是，在临界点以下跨越双结点线进入液—液分层的亚稳定区。显然，只要控制好体系的相平衡和传质行为，就能控制三类材料在复合支架中的结构形态。也就是说，复合体系的相平衡和传质规律，是复合支架结构形态的理论基础。

因此，要开发上述复合细胞支架，需要开展几方面的研究：①细胞支架制备条件与其结构性能的关系。制备条件主要包括材料成分、工艺参数和溶剂特性。材料成份包括第一类、第二类及第三类材料及所占比例，工艺参数包括体系的压力和温度，溶剂特性包括体系溶剂及溶液浓度等；结构性能主要包括支架的几何特性及三类材料在支架中的结构形态等；支架的几何特性包括支架的孔径及孔隙率等。②细胞支架制备条件与其力学性能的关系。力学性能主要包括支架的强度和刚性等。③细胞支架制备条件与其生物性能的关系。生物性能包括支架的降解速率和生物活性等。④制造细胞支架的SAS工艺中多元体系相行为与传质行为。主要针对“第一类材料/第二类材料/第三类材料/溶剂/ScCO2”等组成的复杂多元体系的相平衡关系和质量传递规律进行研究。

通过开展上述4方面研究可达到如下目标：形成一种制备新一代细胞支架的先进工艺—超临界CO2反溶剂工艺，发展一种结构性能、力学性能和生物性能等综合性能优良的新一代骨细胞支架。确定支架制备条件与支架结构性能和力学性能，以及支架降解速率之间的定量关系，为支架结构的优化以及根据使用环境需要对支架的力学强度、刚性及降解特性进行设计奠定基础。确定支架制备条件与支架生物活性间的关系，为支架生物活性最佳设计提供依据。掌握制备支架SAS工艺中复杂体系的相平衡和质量传递规律，为三类材料在支架中的结构形态的最优化提供理论依据。

作为组织工程基本要素的细胞支架，在短短的几十年内取得了重大研究进展。开发新一代细胞支架，使其在结构、力学和生物等方面具有良好的综合性能，是组织工程细胞支架的发展方向。采用先进的SAS工艺，将成生物可降解高分子材料、天然生物可降解高分子材料和生物活性材料等三类材料进行复合，制备性能可调控、综合性能优良细胞支架，是细胞支架研究开发的新途径。SAS工艺涉及的多元复杂体系的相行为和传质行为，是开发SAS工艺的理论基础。

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Research Progress of the New Generation of Scaffolds

LIZhiyi，DING Zhaohong，LIU Zhijun.
Dalian University of Technology,Dalian 116024,China.Corresponding author:LIZhiyi(E-mail：lizy@dlut.edu.cn).

Tissue engineering;Scaffold;Supercritical anti-solvent process

Q813.1+2

B

1673－0364（2012）03－0167－05

2012年3月16日；

2012年4月20日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.03.013

国家自然科学基金项目（30870646）。

116024辽宁省大连市大连理工大学。

李志义（E-mail：lizy@dlut.edu.cn）。

【Summary】Scaffold is critical in building a tissue-engineered organ or tissue.After a short period of fruitful development, the scaffold has been on its way from the first and second generations to the third generation.In this paper,the main characteristics of the third generation scaffold are discussed.The latest developments of the preparative technologies of scaffolds are introduced with the emphasis on the supercritical anti-solvent(SAS)process and its distinguishing features, outstanding advantages and key techniques.It is pointed out that an important way of developing the third generation scaffoldswith excellentand adjustable structural,mechanical and biological characteristics is to prepare the scaffolds by SAS process with the composite materials of three categories:synthetic biodegradable polymers,natural biodegradable polymers and bioactivematerials.By thisway,what is studied and which is achieved are also proposed.