不同来源成体干细胞及不同细胞系的微囊化包裹

张书红 沈 阳 汤亭亭

不同来源成体干细胞及不同细胞系的微囊化包裹

张书红 沈 阳 汤亭亭

目的研究不同来源的间充质干细胞以及不同的细胞系在微囊内的存活情况，为促进骨再生微囊化基因给药平台的建立提供实验基础。方法从大鼠骨髓、脂肪和滑膜中分离培养间充质干细胞（BMSCs、ADSCs和SMSCs），并培养C3H10T1/2、C2C12和NIH/3T3等细胞系，利用高压静电法制作包裹以上细胞的海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸（APA）微囊，然后用EB/Calcein-AM染色方法测定细胞在微囊内1周及4周的存活情况。结果不同来源的间充质干细胞（BMSCs、ADSCs和SMSCs）以及C3H10T1/2、C2C12和NIH/3T3等细胞系在APA微囊内1周及4周的存活率均较高。结论不同来源的间充质干细胞（BMSCs、ADSCs和SMSCs）以及C3H10T1/2、C2C12和NIH/3T3等细胞系可在APA微囊内长期存活。

微囊间充质干细胞细胞系

在细胞治疗和组织工程领域，目前研究和应用较多的细胞是间充质干细胞(MSCs)。MSCs广泛分布于人体各种器官和组织，如骨髓、脂肪和滑膜中，具有取材方便、容易获得等优势。MSCs具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，在不同的诱导条件下，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、肌腱细胞、内皮细胞、真皮细胞和神经细胞等。

MSCs虽然广泛分布于人体各种器官和组织中，但研究最多的是骨髓来源的MSCs，其他如脂肪、滑膜来源的MSCs近年来也有广泛报告。MSCs的分离、培养至今缺乏统一的方法。由于没有可靠的特异性表面标志分子，不易应用流式细胞仪或免疫磁珠对其进行分选。目前MSCs的分离和培养通常采用贴壁培养法，但所得干细胞的特性和状态不尽相同。

在前期研究中，我们已建立了骨髓来源间充质干细胞的微囊化包裹方法。本研究中，我们拟对骨髓、脂肪、滑膜等不同的来源MSCs，以及3种不同来源的细胞系：成纤维细胞系（C3H10T1/2）、成肌细胞系（C2C12）和前成骨细胞系（NIH/3T3）进行微囊包裹，并比较6种细胞在微囊内存活能力的差异，为进一步的基因转染研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

海藻酸钠（Sigma，美国）；聚赖氨酸（FLUKA，美国）；培养基α-MEM（GIBCO，美国）；Calcein-AM（Calbiochem，美国）。

高压静电场成囊装置（上海理工大学研制，中国）；倒置相差显微镜（OLYMPUS，日本）；CO2培养箱（THERMO，美国）；液氮罐（CBS，美国）；台式离心机（Eppendorf，德国）；电子分析天平（METTLER TOLEDO，瑞士）。

1.2 细胞培养

1.2.1 不同来源MSCs的分离与培养

分别取SD大鼠（中国科学院上海实验动物中心提供）的骨髓间充质干细胞（BMSCs）、脂肪干细胞（ADSCs）和滑膜干细胞（SMSCs），用含10%胎牛血清和1%青链霉素的10 m LαMEM培养液培养，接种于10 cm培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱孵育。次日换液以除去死细胞，以后每隔2天换液。待细胞增殖达到80%～90%融合时，用0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化，1∶4传代培养。

1.2.2 三种细胞系的来源和培养

成纤维细胞系（C3H10T1/2）、成肌细胞系（C2C12）和前成骨细胞系（NIH/3T3）均来源于中国科学院上海生命科学院细胞库。C3H10T1/2与NIH/ 3T3用αMEM培养基培养，而C2C12用DMEM培养基培养。

1.3 细胞微囊的制备

参照文献[1]的方法制备包裹干细胞的海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸(APA)微囊。主要步骤如下：①将上述所得细胞悬液与一定浓度的海藻酸钠溶液混合制成细胞悬液，细胞终浓度为3×106cells/mL，海藻酸钠终浓度为1.75%；②置于电压为3 KV、液面距25mm、推进速度30 mm/h的高压静电场成囊装置中，将该混合液滴入100mmol/LCaCl2溶液中并反应10min，0.9%NaCl洗涤2次；③再与0.05%聚赖氨酸溶液反应使微粒外包裹一层聚赖氨酸并反应5 min后 0.9%NaCl洗涤2次；④加入0.15%海藻酸钠溶液中和微粒表面电荷，0.9%NaCl洗涤2次；⑤最后用55 mmol/L柠檬酸钠溶液置换出微粒核心中的钙离子得到微囊，0.9%NaCl洗涤2次；⑥所得微囊置于无菌培养皿中，加入DMEM培养液10mL，于37℃、5%CO2培养箱中培养待用。

1.4 EB/Calcein-AM染色

将细胞微囊用PBS洗涤后，于96孔板中每孔加入100mg/L的EB溶液3μL（终浓度约8μmol/L）及50μmol/L的Calcein-AM溶液10μL（终浓度为5μmol/L）。孵育20min后，在荧光显微镜下观察。Calcein-AM溶液配置步骤如下：①用DMSO配置1mmol/L的Calcein-AM（即在其中加入1mLDMSO-dimethylsulfoxide溶解）；②用PBS稀释至1～50μmol/L，加入1/10培养基的量（100μL加入10μL）。细胞染色后用荧光显微镜观察（激发波长490 nm，发射光512 nm）。注意事项：①Calcein-AM可能水解，因此水溶液需在1 d内使用，DMSO溶液-20℃保存；②在室温下解冻，在打开前短暂离心，重新冻存前密封所有的储存液；③在检测前需将细胞洗涤以去除或稀释血清酯酶活性（通常在血清培养基中存在，因血清酯酶可导致胞外荧光的升高）。

2 实验结果

2.1 骨髓间充质干细胞生长情况

初接种的细胞种类较多，倒置显微镜下可见满视野圆形且折光性较强的细胞，其中多数为红细胞，不贴壁，3 d后半量换液，由于红细胞减少，可见少量的贴壁细胞，呈棒状或纺锤状。7 d后全量换液，瓶内见多个细胞克隆形成，细胞多伸展为长梭形。10 d后，克隆增大与其他克隆逐渐融合。随着换液次数的增加悬浮不贴壁的细胞逐渐被清除，少数夹杂生长。以后3 d换一次培养液。到第14天，贴壁细胞几乎90%汇合（图1A）。

2.2 脂肪干细胞的生长情况

脂肪组织经0.1%Ⅰ型胶原酶消化、红细胞裂解液裂解后，可得到均一乳白色细胞。接种后5～7 h，部分细胞开始贴壁并开始伸出伪足，变为纺锤形或长梭形，24 h后细胞完全贴壁，细胞呈纤维样细胞生长，48 h后，细胞开始增殖，3～5 d达到增殖高峰，呈集落样生长，在6～8 d后达到80%左右融合。从第2代开始，细胞贴壁时间和增殖时间明显加快，2 h内细胞均已贴壁，48 h后细胞可达到80～90%融合。经过多次传代培养，细胞仍然保持旺盛的增殖能力和均一的成纤维细胞样形态学特征（图1B）。

2.3 滑膜干细胞的生长情况

原代SMSCs接种24 h后可见细胞贴壁，形态细长或为多角形，48 h后细胞数量增多，至72 h后便可见大量的纺锤形细胞，其中散在分布少许小圆形细胞。5 d左右可见细胞克隆形成（图1C）。

2.4 三种细胞系的生长情况

C3H10T1/2，C2C12，NIH/3T3三种细胞系均具有繁殖快、生长密度大的特点，一般2～3 d即可长满，当细胞密度达到80%～90%时，需传代于新的培养瓶中，一般传代比例为1∶3或1:4（图2）。

2.5 微囊的制备

利用高压静电装置制造的微囊，无论是包裹细胞的还是未包裹细胞的，微囊形态大小基本一致，直径基本在200μm左右（图3）。

2.6 微囊内细胞的存活

EB/Calcein-AM染色结果显示，微囊内各种细胞在1周及4周的存活率都比较高，基本未看到死亡的细胞（图4、5）。

图1 不同来源成体干细胞的形态，均可见集落形成单位（标尺单位：20μm）Fig.1 Themorphology of different tissue derived adult stem cells with the appearance of colony form ing unit(Scale:20μm)

图2 不同细胞系的生长形态（标尺单位：20μm）Fig.2 The m orphology of different cell lines(Sca le:20μm)

图3 海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊的形态（标尺单位：100μm）Fig.3 Themorphology of alginate-poly-L-lysine-alginatem icrocapsules(Scale:100μm)

图4 不同组织来源的干细胞微囊包裹1周和4周后的存活情况（绿色指示的是存活细胞，红色指示的是死亡细胞；标尺单位：20μm）Fig.4 The viability of different tissue derived cells at 1 week or 4 weeks after encapsulation(The green fluorescence indicates live cells and the red fluorescence indicates dead cells;Scale:20μm)

图5 不同细胞系在微囊包裹1周和4周后的存活情况（绿色指示的是存活细胞，红色指示的是死亡细胞；标尺单位：20μm）Fig.5 The viability of d ifferent cell lines at 1 week or 4 weeks after encapsulation(The green fluorescence indicates live cells and the red fluorescence ind icates dead cells;Scale:20μm)

3 讨论

Friedenstein等最早确认骨髓内含有的成纤维样细胞具备多向分化潜能，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞甚至是成肌细胞。他们将全骨髓放置在塑料的培养皿中，并且在4 h后去除非黏附的大部分造血细胞。这些细胞在经过数次传代之后，在形态上更均一，更类似成纤维细胞。这些细胞因具有分化成不同种类的间充质细胞的能力，被称为骨髓间充质干细胞（MSCs），又因被发现起源于骨髓内复杂的支持结构[2-6]，又被称作骨髓基质细胞。MSCs和 MSCs样细胞现在已经可以自骨髓外的多个部位分离得到，包括脂肪组织、羊水、滑膜、骨膜以及胚胎组织，其表型并不均一[7-11]。国际细胞治疗学会（The International Society for Cellular Therapy，ISCT）已制定了表征MSCs的最主要标准，包括①在标准培养条件下贴壁生长的能力；②特定的表面分子表达，95%以上的细胞表达CD73、CD90（Thy-1）和CD105，不超过2%的细胞表达造血和内皮细胞的标志，即CD34、CD45、CD11b或CD14、CD19或CD79a等；③具备向骨、软骨和脂肪至少三个方向上的分化能力[12]。

本研究中，我们使用了全骨髓培养法，利用骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性来分离MSCs。全骨髓培养法是一种保留红细胞和其他各种细胞混合培养的方法，该方法由于维持了BMSCs原始的生活环境，有利于BMSCs的分化，且操作过程也较为简便。研究中观察到原代培养的BMSCs呈集簇状克隆生长，传代后细胞贴壁迅速，生长增殖旺盛，约2～3 d便可传代一次，短期内即可培养获得大量细胞。脂肪干细胞也同样生长迅速，短期内也能大量获得。但是滑膜细胞的量较少，细胞获取的时间比较长，这可能与大鼠滑膜组织较小有关。

为避免非自体干细胞可能引起的排异反应，本研究中尝试利用微胶囊来包裹各种原代的干细胞和一些具备成骨分化潜能的细胞系。微囊表面有选择性透过膜，可避免免疫系统对囊内细胞的攻击，而小分子的营养物质和囊内生物活性物质及代谢产物可以自由出入，这样保证了微囊内细胞的存活。在微囊的制备中，材料的选择尤其重要。作为细胞移植的包封材料，一般要求具有优良的生物相容性，长期的生物与机械稳定性，一定的机械强度和良好的成膜性。细胞微囊几乎均由水凝胶制备而成。这是一类可在水中膨胀但不溶解的合成或天然聚合物材料。作为制备细胞微囊的理想材料，水凝胶应该具有以下特性：①易于形成光滑透明的胶囊，可方便观察胶囊内的细胞状态；②组织周围的机械或摩擦刺激可以通过凝胶柔软圆滑的特性而消除；③由于材料的亲水性，在流体和组织周围无界面张力，这样可将蛋白吸附和细胞黏附减小到最低限度，使微囊具有良好的生物相容性；④水凝胶对低分子量营养物和代谢物具有较高通透性；⑤材料通过聚电解质络合原理在生理条件下成膜，反应条件温和，有利于移植细胞的活性保存。其中以Lim等[13]的APA（海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠）微囊制作方法在细胞移植中的应用最多。

包裹细胞的APA微囊是以海藻酸钠为核心，周围包裹阳离子聚合物材料聚赖氨酸，外面再包裹海藻酸钠制成。它具有制备条件温和、生物相容性好的特点，目前关于细胞微囊的研究中有超过85%的文献应用了此种方法。与其他成囊方法相比，该方法所制得的微胶囊形状规则呈球形、表面较光滑、均匀性较一致，特别适用于细胞的微囊化研究。2000年，李保国等[14]用高压静电法制作胰岛细胞微胶囊取得成功。前期研究中，我们也尝试用微囊来包裹骨髓MSCs并获成功[1，15-16]。

据报道，微囊的大小与微囊内细胞的存活也有关系，较小的微囊更能减少免疫细胞对于微囊的排斥反应[17]。在将微囊植入体内时，由于血管释放营养和氧气的最大有效距离为200μm[18]，为了能确保微囊内的细胞获得更多的营养和氧气，缩短微囊与血管的距离显得尤其重要，较小微囊内的细胞更能够得到长期的存活。Robitaille等[19]发现微囊内细胞的死亡主要是由于营养不足，较大微囊(大于200μm)内细胞死亡更多。Sugiura等[20]认为微囊的直径不要超过300～400μm。Zhang等[21]则认为微囊的直径应在100μm左右，微囊内细胞的存活会更好。但微囊过小其内部能容纳的细胞量也较少，本研究中制备的微囊大小直径在200μm左右。研究结果证明，各种原代的干细胞与细胞系均可以在此APA微囊中长期存活。

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The Growth and Viability of Different Tissue Derived Mesenchymal Stem Cells and Different Cell Lines in Microcapsules

ZHANG Shuhong,SHEN Yang,TANG Tingting.
Shanghai Key Laboratory of Orthopaedic Implant, Department of Orthopaedics,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:TANG Tingting(E-mail：tingtingtang@hotmail.com).

Objective To observe the growth and viability of different tissue derived mesenchymal stem cells and different cell lines in microcapsules and to provide the experimental basis for the establishment of the m icroencapsulated gene medicine strategy.Methods The bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs),adipose-derived stem cells(ADSCs), synovium-derived mesenchymal stem cells(SMSCs)were isolated from rat.These cells,along with the C3H10T1/2 cell lines, C2C12 cell lines and NIH/3T3 cell lines,had been encapsulated in the alginate-poly-L-lysine-alginate(APA)microcapsules producing by high voltage electrostatic generator.The viability of cells in APA m icrocapsules were determ ined by EB/ Calcein-AM dyeing method.Results The survival rates of different tissue derived mesenchymal stem cells including the BMSCs,ADSCs and SMSCs,as well as the C3H10T1/2 cell lines,C2C12 cell lines and NIH/3T3 cell lines were high at 1 week and 4 weeks after encapsulation.Conclusion Different tissue derived mesenchymal stem cells including the BMSCs, ADSCs and SMSCs,as well as the C3H10T1/2 cell lines,C2C12 cell lines and NIH/3T3 cell lines could survive for a long time after encapsulation.

Microcapsules;Mesenchymal stem cells;Cell lines

Q813.1+1

A

1673－0364（2012）03－0130－06

2012年4月5日；

2012年4月21日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.03.003

国家自然科学基金（30772183、81172549）；上海高校创新团队（第一期）发展计划；上海市教委重点学科建设（J50206）。

200011上海市上海市骨科内植物重点实验室，上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科。

汤亭亭（E-mail：tingtingtang@hotmail.com）。