神经导管联合自体变性肌桥修复大鼠周围神经缺损的实验研究

李 政 周 明

神经导管联合自体变性肌桥修复大鼠周围神经缺损的实验研究

李 政 周 明

目的探讨PLGA神经导管联合化学萃取的自体骨骼肌肌桥，修复大鼠坐骨神经缺损的可能性。方法SD大鼠45只，建立大鼠左侧坐骨神经缺损模型。随机分为3组，分别采用自体神经（A组）、PLGA神经导管（B组）和PLGA神经导管联合化学萃取自体骨骼肌肌桥（C组），来修复神经缺损。术后通过大体观察、坐骨神经功能指数测定、腓肠肌湿质量恢复率测定、组织学观察和图像分析对比等，检测神经缺损修复情况。结果神经导管联合化学萃取自体骨骼肌肌桥能促进坐骨神经再生，各项指标均优于单纯神经导管移植，但是效果略差于自体神经移植。结论PLGA神经导管联合化学萃取自体骨骼肌肌桥，对大鼠坐骨神经缺损具有良好的桥梁作用和促神经生长的作用。

神经再生神经导管聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物变性骨骼肌肌桥

周围神经长段缺损是临床较棘手的问题，目前的最佳修复方法依旧是自体神经移植，但存在诸多缺点。多年来人们一直在尝试应用人工神经来修复周围神经的长段缺损，但尚无理想结果。

理想的人工神经应是一种特定的三维结构支架的神经导管，可接纳再生轴突的长入，对轴突起机械引导作用；导管材料应具有良好的组织相容性、适当的孔径和孔隙率、可降解性及降解速率可调控性，并具备一定的机械强度和柔韧性。

本实验研究采用可降解的神经导管，联合化学萃取自体肌肉，制作肌肉基底膜管以促进大鼠坐骨神经的再生，为修复周围神经缺损提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Triton X-100（P ackard，USA）；D eoxycholate钠盐（Sigma，USA）；聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物PLGA（四川国家生物材料工程公司）。

1.2 实验动物及分组

雄性SD大鼠45只（江苏大学实验动物中心提供），随机分为3组，每组15只。A组为自体神经移植组；B组为PLGA神经导管组；C组为PLGA神经导管联合自体肌桥化学萃取组。

1.3 肌桥的化学萃取

所有实验动物均在腹腔麻醉下，从左侧股二头肌处切取3 cm×2 cm×1 cm大小的肌条。采用Sondell法[1]进行化学萃取，制备无细胞基底膜管移植物，将股二头肌肌条置于蒸馏水内，在室温下保持7 h并换液数次，然后置于3%的Triton X-100蒸馏水溶液中室温过夜（12 h），接着置于4%的Deoxycholate钠盐蒸馏水溶液中连续震荡24 h，进行萃取处理。上述程序重复一遍，最后将萃取后的移植物水洗后置于4℃、pH 7.2的磷酸缓冲液中保存备用。

1.4 PLGA神经导管的制作[2]

聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物PLGA（85∶15）制成管长12 mm、壁厚0.3 mm、内径1.5 mm的神经导管；导管置于P2O5的干燥器中，-20℃保存，导管植入体内前甲醛熏蒸4 h。

1.5 手术方法

10%水合氯醛腹腔注射麻醉。大鼠俯卧位，由原手术切口分离显露大鼠左侧坐骨神经，A组于坐骨神经中段切取神经干l0mm，近远端颠倒后9-0线两端各缝合2针。其他两组均锐性切除坐骨神经干6 mm，让断端缺损自然回缩至10 mm；B组用9-0线将PLGA导管两端缝合固定；C组将自体化学萃取肌肉修剪为长9 mm、直径1.5 mm左右的桥段置入神经导管，神经断端两端各插入1mm，9-0线导管两端缝合固定。术毕庆大霉素冲洗并关闭切口。术侧大鼠下肢管形石膏固定，2周后去除石膏。

1.6 检测方法

1.6.1 大体观察

术后定期观察各组术侧足底、足趾的皮肤溃疡情况，以及后肢肌肉萎缩程度和关节屈伸情况。

1.6.2 坐骨神经指数

术后第2、4、6、8周，各组SD鼠双后足涂上碳素墨水，置于自制的大鼠足印行走箱中，得到相应足印，测量各指标，代入公式计算坐骨神经指数。参考文献[3]的方法，选择印迹清晰的足印分别测量正常足(N)和伤侧足(E)的3个指标：足印长度（PL）即足尖到足跟的最大距离；足趾宽度（TS）即第1～5趾的距离；中间足趾宽度（IT）即第2～4趾的距离。坐骨神经指数=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS] +13.3[(EIT-NIT)/NIT]-8.8。坐骨神经指数0%～-11%表示神经功能完全正常，-100%表示神经功能完全丧失，-11%～-100%表示部分神经功能恢复。

1.6.3 腓肠肌湿质量恢复率

仔细分离双侧腓肠肌，测量其湿质量，计算腓肠肌湿质量恢复率。腓肠肌湿质量恢复率(%)=手术侧腓肠肌湿质量/正常侧腓肠肌湿质量×100%。

1.6.4 组织学观察

术后4周、8周和12周切取移植物，甲醛固定，石蜡包埋，甲苯胺蓝染色，光镜观察。采用计算机图像分析系统分析移植体中部的横切面，计算出神经纤维有效面积、髓鞘厚度和神经纤维密度。

1.6.5 电镜标本制作及观察

自移植物中段取材，4%戊二醛、1%锇酸固定，乙醇逐级脱水，Epon812包埋、切片，铅－铀染色，透射电镜观察。

1.7 统计学分析

所有数据用均数±标准差表示，应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察

术后各组实验动物均表现为左侧后肢拖地行走，术后1周足部皮肤出现红肿和足跟溃疡，术后2周小腿三头肌出现明显萎缩，之后小腿三头肌萎缩逐渐恢复，足跟部皮肤红肿或溃疡逐渐消退。至术后取材时各组大鼠均存活，切口愈合良好。

2.2 坐骨神经指数

术后2、4周，各组坐骨神经指数差异无统计学意义（P＞0.05）；术后8周，A组坐骨神经指数与B、C组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；移植后12周，A组坐骨神经指数略高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；C组指数高于B组，差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。

表1 术后2、4、8、12周各组坐骨神经指数Table1 Sciatic nerve function index of each group 2,4,8 and 12 weeks after operation

2.3 小腿三头肌湿质量恢复率

术后12周，A、B、C组小腿三头肌湿质量恢复率分别为（75.2±4.7）%、（43.3±4.1）%和（61.9±4.4）%。C组与A、B组比较差异均有统计学意义（P＜0.01），C组与B组比较差异也具有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 移植神经吻合口远段甲苯胺蓝染色观察

12周取材后的甲苯胺蓝染色显示，C组再生的神经纤维较多，且排列整齐（图1）,神经数量和轴突直径以及髓鞘厚度均优于B组（图2），差异有统计学意义（P＜0.01）。A组各项指标均强于C组，其中神经纤维有效面积（P＜0.01）和神经纤维密度（P＜0.05）差异具有统计学意义，A组髓鞘厚度稍强于C组，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

图1 C组12周再生神经中段横切面观（甲苯胺蓝染色，400×）Fig.1 Transverse view of regenerated nerve of group C 12 weeks after operation(toluidine blue staining,400×)

图2 B组12周再生神经中段横切面观（甲苯胺蓝染色，400×）Fig.2 Transverse view of regenerated nerve of group B 12 weeks after operation(toluidine blue staining,400×)

表2 术后12周各组再生神经图像分析结果Table2 Regenerated nerve image analysis of each group 12 weeks after operation

2.5 透射电镜观察

术后12周透射电镜观察，C组（图3）相对于B组（图4）再生的有髓神经纤维多，髓鞘较厚并且完整，板层排列紧密，轴突膜与髓鞘膜紧密相邻；但是稍差于A组。

图3 C组12周再生神经中段横切面观（透射电镜，5 000×）Fig.3 Transverse view of regenerated nerve of group C 12 weeks after operation(TEM,5 000×)

图4 C组12周再生神经中段横切面观（透射电镜，5 000×）Fig.4 Transverse view of regenerated nerve of group B 12 weeks after operation(TEM,5 000×)

3 讨论

众所周知，长段的周围神经缺损修复的最佳方法目前仍是自体神经移植，但是自体神经的来源有限，且可导致供区神经功能丧失或痛性神经瘤可能。为了获得更佳的神经修复效果，人工神经成为目前研究的热点之一。

以往的研究表明，单纯神经导管移植能促进周围神经的再生，疗效接近自体神经移植。其原理就是神经断端间用套管桥接，形成相对密闭的再生室，充分发挥神经再生的趋化特性、自我调节能力及自我修复能力。

有文献报道，通过对骨骼肌进行化学萃取或冷热变性后形成变性肌桥，来修复周围神经的缺损[4-6]，取得了一定的效果。但是由于单纯肌桥周围没有神经导管对外周环境进行隔绝，导致肌桥容易被炎性组织浸润而导致疤痕化，或者被外周组织压迫而影响再生的神经纤维，从而影响了促进神经再生的效果。

本实验采用PLGA神经导管，联合变性的肌桥来对周围神经缺损进行修复。优点如下：①神经导管对肌桥和神经断端周围环境进行相对的隔绝，避免了周围组织的压迫和炎性组织的浸润；②形成神经再生室，可充分发挥神经再生的自我调节、自我修复能力；③理想的人工神经应该能模拟自体神经的结构，具备三维立体支架结构，为再生的神经轴突和许旺细胞提供“脚手架”，使许旺细胞和轴突沿支架有序纵向排列，引导神经再生。本实验采用化学萃取的方法制作肌肉基底膜管，来模拟形成一种中空网管状结构[7-8]，肌肉基底膜含有层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，能促进周围神经再生，有助于许旺细胞黏附及轴突沿支架延伸生长。自体肌肉基底膜管不会产生排斥反应[9]；④PLGA神经导管已得到美国FDA临床应用许可，具有良好的组织相容性。

本实验的各项检测结果显示，各组均能有效引导大鼠坐骨神经再生并通过大鼠坐骨神经缺损间隙，神经导管联合化学萃取自体肌桥组神经修复效果优于单纯的神经导管组，说明通过对自体肌肉化学萃取而形成的肌肉基底膜管能促进周围神经的再生。但是神经导管联合肌肉基底膜管组的神经修复效果仍然差于自体神经移植组。

为了进一步获得更好的神经修复效果，我们将在后续研究中添加神经营养因子、种子细胞等，并进一步研究和比较各种肌肉变性方法所制作的肌肉基底膜管的性能、结构和神经修复效果差异。

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Denatured A utologous Muscle Graft Combining PLGA Nerve Guide Conduits in Repairing Peripheral Nerve Defects

LIZhen,ZHOU Ming.
Emergency Medical Center,Zhenjiang First People's Hospital,Zhenjiang 212002,China. Corresponding author:ZHOU Ming(E-mail：zhouming212002@163.com).

Objective To explore the feasibility of denatured autologous muscle graft combining PLGA Nerve guide conduits in repairing sciatic nerve defects in rats.M ethods Forty-five Sprague-Dawley rats were random ly divided into three groups(n=15)and the left sciatic nerve defectsmodelwas established on each rat.Autologous nerve(group A),PLGA nerve guide conduits(group B)and denatured autologousmuscle graft combining PLGA nerve guide conduits(group C)were used to bridge the nerve defects.Microscopic observation,sciatic nerve function index，recovery rate of gastrocnemius wet weight,histological observation and computerized imaging analysis were carried out postoperatively.Results The findings showed that denatured autologousmuscle graft combining nerve guide conduitswas better than nerve guide conduits,but less effective than autologous nerve transplantation.Conclusion Denatured autologous muscle graft combining nerve guide conduits can promote the peripheral nerve regeneration and repair nerve defects.

Nerve regeneration;Nerveguide conduits;Poly(lactide-co-glycolide);Denatured autologousmusclegraft

R622+.3

A

1673－0364（2012）03－0146－04

2012年3月2日；

2012年3月25日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.03.006

212002江苏省镇江市镇江市第一人民医院急诊医学中心。

周明（E-mail：zhouming212002@163.com）。