CTLA-4、PTPN22基因多态性与温州地区汉族人桥本甲状腺炎的相关性

应俊，邵海刚，潘若望，李佩珍，张洪勤，曾兴业

（1.温州医学院 生物学实验教学中心；2.温州医学院 检验医学院；3.中国人民解放军第118医院外科，浙江 温州 325000）

桥本甲状腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）是一种器官特异性免疫疾病，属于自身免疫性甲状腺病（autoimmune thyroid disease，AITD）的一种，在自身免疫性甲状腺炎中位居榜首，约占7.3%～20.5%，男女患病比例为1:6～1:10[1]。温州地区位于我国东南沿海，甲状腺疾病是当地的常见病之一，其发病率明显高于内陆地区[2]。HT发病机制至今尚未彻底阐明，目前普遍认为，HT是环境和遗传共同作用的多基因遗传性疾病，其中遗传因素在HT的发病中起着十分重要的作用。为进一步明确病因，我们对HT患者进行了基因检测，观察温州地区汉族人群细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）外显子1第49位点和PTPN基因启动子-1123位点是否存在多态性以及与HT的相关性，探讨HT的遗传背景。

1 对象和方法

1.1 对象 为温州地区汉族人，均排除其他自身免疫性疾病史和严重的心、肝、肾疾病。①HT组：选自2006年9月-2011年3月就诊于温州医学院附属第二医院、解放军118医院内分泌科的HT患者150例，其中男60例，女90例，年龄40～53岁，平均（46.8±5.6）岁。HT的诊断依据为典型的临床表现结合实验室检查，详见森田陆标准[3]。②健康对照（CN）组：从我院体检中心按HT患者的年龄分布、性别构成随机选取健康体检者120例，其中男48例，女72例，年龄39～55岁，平均（45.7±6.4）岁。两组患者年龄、性别差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 方法 用5% Chelex-100快速提取法[4]提取模板DNA。利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术进行CTLA-4的外显子1+49位的多态性分析，上游引物：5’-GAAGGATGGTGCTTCACA GAT-3’，下游引物：5’-CTTTGCAGAAGACAGGGATGA-3’，上海捷瑞公司合成。反应条件：94 ℃ 5 min→94 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35个循环→72 ℃ 7 min→4 ℃保存，扩增产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察结果。

利用单一等位基因特异性引物-聚合酶链反应（PCR-SASP）技术进行PTPN基因启动子-1123SNP分析。PTPN22-1123 G > C F1：5’- CATTGAGAGGTTATG CAAGCTC-3’，F2：5’-CATTGAGAGGTTATGCAAGCTG-3’，R：5’-ACCCTGCATATGTAATGCTGGT-3’（上海捷瑞公司合成）。PCR产物全长268 bp，每份标本均使用F1和F2进行扩增，F1与R组成一对引物扩增G等位基因，F2与R组成一对引物扩增C等位基因，根据PCR产物的有无区分基因型。以0.2μg DNA为模板在反应体积为30μL内进行PCR扩增，反应条件：94 ℃ 5 min→94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35个 循环→72 ℃ 7 min→4 ℃保存，扩增产物经1%琼脂糖电泳，溴化乙啶显色，紫外灯下观察结果。

1.3 统计学处理方法 数据采用SPSS13.0统计软件进行处理。以Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性，运用基因计数法计算各组基因频率及等位基因频率。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTLA-4基因外显子1+49A>G位点的PCR-RFLP分析 CTLA-4外显子1的PCR扩增片段长度为652 bp，经Bbv I酶切可得到3种结果：49A/G SNP为基因型AA时产生556 bp和96 bp 2个片段；基因型GG时产生480 bp、96 bp和76 bp 3个片段；基因型AG时产生556 bp、480 bp、96 bp和76 bp 4个片段。由于96 bp和76 bp相对分子质量小，电泳只显示556 bp 和480 bp（见图1）。

图1 CTLA-4外显子1酶切产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（M：DNA分子质量标准；1：PCR产物；2：AA纯合型；3：GG纯合型；4：AG杂合型）

2.2 PTPN22基因启动子-1123位点的SASP-PCR分析 PTPN22启动子扩增片段的长度为268 bp，引物F1针对等位基因G，引物F2针对等位基因C。-1123SNP为GG基因型时F1可扩增出PCR产物；CC基因型时F2可扩增出PCR产物；GC基因型时2对引物均可扩增出PCR产物（见图2）。

图2 PTPN基因启动子扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图（1、2：CC纯合型；3、4：GG纯合型；5、6：GC杂合型；7：DNA分子质量标准）

2.3 CTLA-4+49A>G位点（rs231775）多态性在温州汉族人群HT组和CN组间各基因型及等位基因频率比较 CTLA-4 49A>G SNP基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，两组各基因型和等位基因分布频率差异有统计学意义（见表1）。

表1 HT组和CN组CTLA-4基因（rs231775）基因型及等位基因分布频率比较

2.4 PTPN22启动子-1123G>C位点（rs2488457）多态性在温州地区汉族人群HT组和CN组间各基因型及等位基因频率比较 PTPN22-1123G>C SNP基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，两组各基因型和等位基因分布频率差异有统计学意义（见表2）。

表2 HT组和CN组PTPN22基因（rs2488457）基因型和等位基因分布频率比较

2.5 CTLA-4 +49 A>G位点（rs231775）、PTPN22启动子-1123G>C位点（rs2488457）基因多态性对HT的相对危险度 CTLA-4基因rs231775位点相对AA基因型而言，GG基因型能显著增加HT发生的危险性；PTPN22基因rs2488457位点相对于GG基因型而言，GC与GG+GC基因型均能显著增加HT发生的危险性。等位基因频率的相对风险分析发现，CTLA-4外显子1+49位点G等位基因携带者患HT的风险是A等位基因的1.616倍（OR=1.616，95%CI：1.142～2.285），PTPN22启动子-1123位点C等位基因携带者患HT的风险是G等位基因的1.459倍（OR=1.459，95%CI：1.034～2.059）。具体见表3。

表4 CTLA-4基因和PTPN22基因的多态性对HT的相对危险度

3 讨论

HT是一种器官特异性的自身免疫性疾病，其发病涉及免疫、遗传、环境等因素，但是确切的机制尚未明了。不同基因和不同的环境因子在不同人群中起着不同的作用，因此确定HT易感性的相关基因成为国内外病因学研究热点之一。

近年的研究表明：CTLA-4基因多态性与多种自身免疫性疾病的发生风险相关，提示其可能是一新的自身免疫性疾病的遗传易感基因，已成为目前研究的热点。许多研究均证明CTLA-4基因外显子1+49位点存在的多态性与自身免疫性疾病密切相关，但所显示的结果并不完全一致。Antonio等[5]报道意大利人群中CTLA-4外显子1+49A/G的多态性与AITD呈显著相关，Bicek等[6]、Esteghamati等[7]、王巧宏等[8]也均支持49位点G等位基因是AITD的危险因素之一；另外， Namo Cury等[9]探讨了巴西人CTLA-4+49A/G的多态性，发现差异无统计学意义；师志云等[10]发现49位点G等位基因与Graves病显著相关，与HT的发生无关。说明CTLA-4基因多态性存在民族、地区之间的差异。本研究发现HT组CTLA-4+49A/G基因型频率、等位基因频率与CN组相比差异有统计学意义，+49位点带有A/A基因型的个体对HT的发生具有一定的抵抗能力，即那些带有G/G基因型的个体对HT具有易感性。此外，疾病组+49G等位基因频率显著高于对照组（OR=1.616，95%CI：1.142～2.285，P=0.007）。49位点A/G的二态性导致苏氨酸/丙氨酸的交换可影响前导链的构成，使之不能正确引导细胞内CTLA-4分子运输致使细胞表面CTLA-4分子减少，而引起HT的发生。对HT发病的确切机制以及如何利用CTLA-4的负性调节作用来诱导机体产生免疫耐受而控制疾病的发生等则有待于进一步研究和探讨。

蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22（protein tyrosine phosphatase nonreceptor-22，PTPN 22）基因被认为是HLA、CTLA-4之外最为重要的人类自身免疫性疾病的易感基因，定位于1p13，编码淋巴蛋白酪氨酸磷酸酶（lymphoid protein tyrosine phosphatase，LYP），在T细胞信号通路里起着负调节作用。第一个被识别的PTPN22基因多态性是位于620密码子1858位C/T，该多态性造成精氨酸到色氨酸突变[11]。最近，日本学者Kawasaki等[12]通过对TID患者PTPN22全基因扫描的研究发现日本人群有5个新的SNP位点，其中-1123G>C突变是另外一个与自身免疫病发病甚为相关的、出现频率较高的突变位点，结果显示一个启动子区域的SNP-1123G>C与快速发病型的1型糖尿病相关，这种关联在日本人群、朝鲜族人群和高加索人群中均有发现。本研究结果显示PTPN22-1123G>C（rs2488457）多态性位点存在三种基因型，相对于GG基因型而言，GC与GG+GC基因型均能显著增加HT发生的危险性；-1123C等位基因携带者患HT的风险是G等位基因的1.459倍（OR=1.459，95%CI：1.034～2.059）。可见，PTPN22基因启动子的-1123G>C SNP与温州汉族人群HT的发生有相关性，与于志云等[13]报道该位点的SNP与Graves病的发生相关的结果一致。目前关于-1123位点基因多态性如何影响LYP的表达仍不明确，但是分析该位点周围基因DNA序列，发现-1123G与转录因子激活蛋白4（AP-4）的结合位点匹配，而且正好落于AP-4结合共有序列的核心位置上（-1130gcaaGCTGaa-1121）[14]，而-1123C等位基因不能与任何已知的转录因子的结合元素相匹配，可能因此影响了Lyp的转录效率。但关于PTPN22-1123位点基因多态性在HT的发生、发展过程中产生作用的具体机制仍有待于进一步的研究。

HT是一种多基因遗传性疾病，基因之间的相互作用可能影响疾病的发生。我们的研究提示CTLA-4基因和PTPN22基因都是HT的易感基因，两基因均为突变时增加了HT发生的机会。即说明两基因的变异对疾病的发生起协同作用，对这一协同作用的病理生理基础的解释还有待于更深入的研究。

总之，作为一种多基因疾病，HT遗传易感性可能由多个外显率不同的基因决定，不同的环境因素以及环境因素与遗传易感因素之间的相互作用，决定了HT的发生发展。因此，不仅要关注以环境因素为主导作用的致病因素，还应从基因水平进行探讨，CTLA-4基因、PTPN22基因多态性类型将可能对HT等自身免疫性疾病的发展、诊断、治疗（包括基因治疗）提供新的思路。

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