高糖环境对HBZY-1大鼠肾小球系膜细胞IL-18、TGF-β1表达的影响

潘晓燕，龚小花，杨丽娟，沈飞霞

（温州医学院附属第一医院 内分泌科，浙江 温州 325000）

近年来，2型糖尿病的发病率明显增加，其危害性主要表现在慢性并发症导致的高致死率、高致残率[1]。糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是其典型的微血管并发症之一。研究表明，由DN造成的肾功能衰竭比非糖尿病患者高17倍，是糖尿病患者主要死亡原因之一，因此DN的防治工作关系重大。

近年有研究证实炎症递质在DN病理发展中扮演着重要角色。白细胞介素18（IL-18）是IL-1细胞因子家族的成员，主要由活化的单核巨噬细胞产生，其他组织细胞也广泛表达，在免疫调节以及多种免疫相关性疾病的发生、发展、转归中都起着重要作用[2]。最近研究发现，早期DN患者血浆IL-18显著升高，且高水平IL-18能加重DN动物模型肾功能的衰竭，这提示IL-18很可能是启动DN患者肾功能走向衰竭的早期关键环节之一[3-6]。DN肾组织中转化生长因子β1（TGF-β1）高表达是DN肾功能恶化的经典途径之一。然而，DN肾组织中TGF-β1升高的原因仍不完全清楚。研究表明IL-18能通过与IL-18受体的结合激活NF-κB信号转导途径诱导TH1细胞产生IFN-γ、IL-2等细胞因子。在此基础上，本研究以IL-18作为DN抗感染治疗的靶点，选择肾小球系膜细胞（mesangial cells，MCs）作为研究的靶细胞进行研究，观察高糖环境下IL-18和TGF-β1的表达及两者的相互关系，并阻断IL-18观察TGF-β1的表达变化。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠肾小球系膜细胞系（HBZY-1，中国典型培养物保藏中心），葡萄糖（Sigma），IL-18抗体（Santa cruz），TGF-β1抗体（Abcam），二抗（CST），倒置显微镜（Leica），荧光定量PCR仪（Roche 480）。

1.2 方法 肾小球系膜细胞加入ATCC完全生长培养液（含3×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素及10%灭活小牛血清），置于37 ℃、5% CO2浓度、体积分数为0.05的饱和湿度培养箱中，每日换液1次，3～4 d传代1次。

1.2.1 实验分组：取对数生长期的系膜细胞进行分组实验：①正常糖组（NG组）: ATCC培养液中加入葡萄糖（终浓度5.5 mmol/L）；②高糖组（HG组）：在培养液中加入葡萄糖（终浓度25 mmol/L）；③IL-18正常糖组（IL-18/NG组）：在培养液中分别加入四个不同浓度IL-18[1 ng/dL（IL-18/NG-1组）、10 ng/dL（IL-18/NG-2组）、50 ng/dL（IL-18/NG-3组）、100 ng/dL（IL-18/NG-4组）]+葡萄糖浓度5.5 mmol/L；Con/NG-O组培养液中未加入IL-18，作为对照组。④IL-18高糖组（IL-18/HG组）：在培养液中分别加入四个不同浓度IL-18[1 ng/dL（IL-18/HG-1组）、10 ng/dL（IL-18/HG-2组）、50 ng/dL（IL-18/HG-3组）、100 ng/dL（IL-18/HG-4组）]+高糖（25 mmol/L）；Con/HG-O组培养液中未加入IL-18，作为对照组。⑤IL-18抗体-正常糖组（IL-18Ab/NG组）：在培养液中加入IL-18 Ab 100 g/dL+葡萄糖浓度5.5 mmol/L；⑥IL-18抗体-高糖组（IL-18Ab/HG组）：在培养液中加入IL-18 Ab 100 g/dL+葡萄糖浓度25 mmol/L。通过IL-18抗体拮抗IL-18来阻断TGF-β1的表达。系膜细胞以每孔2×105个细胞数接种到6孔培养板，每组设3个复孔（n=3）。

1.2.2 荧光定量PCR检测IL-18和TGF-β1 mRNA的表达：每孔弃培养液，按说明书Trizol法提取细胞总RNA，用Oligo（dT）18进行逆转录制备cDNA。按照说明书使用胶回收法纯化DNA片段作为标准品。用SYBR Green I荧光嵌合法在Rea1-time的PCR仪上进行荧光定量PCR检测。选取β-actin为内参照。引物序列如下β-actin：上游5’-GTAAAGACCTCTATGC CAACA-3’，下游5’-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3’；IL-18：上游5’-CAACCGCAGTAATACGGAGCAT-3’，下游5’-TCTGGGATTCGTTGGCTGTT-3’；TGF-β1：上游5’-ACCTTGG TAACCGGCTGC-3’，下游5’- TCCTTGGTTCAGCCACTGC-3’。反应条件如下：94 ℃预变性2 min；然后进行94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环;最后72 ℃延长7 min，2次，在延伸的过程中收集荧光信号，扩增结束后收集溶解曲线。采用标准曲线法计算mRNA的相对表达量。IL-18 mRNA相对表达量/β-actin mRNA相对表达量和TGF-β1 mRNA相对表达量/β-actinm RNA相对表达量分别为为IL-18和TGF-β1的mRNA表达量校正值。每个样本均设3个复孔。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS16.0统计软件进行分析。各组数据均以±s表示。多组间差异比较采用单因素方差分析，组内两两比较方差齐者采用SNK法，方差不齐者采用Games-Howell法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖对IL-18、TGF-β1水平的影响 IL-18 mRNA表达量NG组为1.06±0.47，HG组为8.75±0.34；TGF-β1 mRNA表达量NG组为1.03±0.31，HG组为7.23±1.18，与NG组比较，HG组IL-18、TGF-β1 mRNA表达均增强，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 TGF-β1 mRNA在不同浓度IL-18条件下的表达（±s）

表1 TGF-β1 mRNA在不同浓度IL-18条件下的表达（±s）

与Con/NG-O组、Con/HG-O组比：aP＜0.05；bP＜0.01；HG同浓度各组与NG各组比：cP＜0.01

分组IL-18的浓度IL-18/NG组0 1 1 0 50 100 IL-18/HG组Con/NG-0组IL-18/NG-1组IL-18/NG-2组IL-18/NG-3组IL-18/NG-4组Con/HG-0组IL-18/HG-1组IL-18/HG-2组IL-18/HG-3组IL-18/HG-4组0 1 1 0 50 100 TGF-β1 mRNA 表达量1.01±0.18 1.39±0.04a 1.55±0.15a 2.06±0.05b 2.93±0.29b 4.36±0.50 6.67±0.20bc 8.87±0.44bc 9.91±0.79bc 9.84±0.57bc

2.2 IL-18对TGF-β1水平的影响 相同浓度IL-18条件下，IL-18/HG组TGF-β1 mRNA的表达水平均高于IL-18/NG组；TGF-β1 mRNA表达随IL-18浓度增高而增加。TGF-β1表达升高依赖于IL-18，且有剂量依赖性。具体见表1。

2.3 IL-18对TGF-β1水平的影响 在NG组和HG组，分别加入100μg/dL的IL-18 Ab，结果表明在髙糖情况下通过IL-18抗体拮抗IL-18可抑制TGF-β1的表达（P＜0.01）。具体见表2。

表2 TGF-β1 mRNA在阻断IL-18后的表达（±s）

表2 TGF-β1 mRNA在阻断IL-18后的表达（±s）

与NG组比：aP＜0.01；与HG组比：bP＜0.01

分组 药物和浓度TGF-β1 mRNA的表达量

3 讨论

DN的发病机制目前仍不十分清楚，除传统的代谢和血流动力学因素对肾脏的损伤外，目前认为免疫和炎症递质在DN病理发展中扮演着重要角色[2]。最近研究发现，早期DN患者血浆IL-18显著升高，且高水平IL-18能加重DN动物模型肾功能的衰竭，这提示IL-18很可能是启动DN肾功能走向衰竭的早期关键环节之一。本研究以大鼠肾小球系膜细胞为对象，研究高糖环境下IL-18与TGF-β1表达及其相互关系，探讨IL-18在DN肾功能衰竭疾病机制中的作用及意义。

IL-18是IL-1细胞因子家族的成员，它的结构与IL-1β相似，但它在炎症和免疫调节过程中具有不同于IL-1β的特性[7]。最近研究发现，DN患者血和尿IL-18水平升高，且高水平IL-18与低肾脏功能显著相关；此外，糖尿病患者即使在正常尿蛋白期，其IL-18浓度较对照组亦明显升高，且高水平IL-18与肾小球滤过率下降显著相关[3-6]；动物实验发现，每日注射IL-18，使非糖尿病动物体内IL-18升高，其尿蛋白排泄率显著升高，而预先注射IL-18保护性抗体，IL-18升高尿蛋白排泄率的作用消失[8]。由此可见，IL-18在早期DN患者体内显著升高，且IL-18很可能是启动DN肾功能走向衰竭的早期关键靶点。本研究发现高糖可以导致IL-18和炎症因子TGF-β1表达升高，证实了IL-18与高糖导致的肾小球系膜细胞炎症及损伤有关，但是IL-18是作为调节因子还是效应因子发挥作用，目前仍不清楚，探讨其具体的作用机制有助于进一步了解DN炎症持续的免疫学机制，为寻找新的治疗策略带来新的思路。

DN的病理改变是肾小球细胞外基质进行性积聚，基底膜增厚，滤过面积减少，肾小球进行性纤维化，最终可导致终末期肾病。DN肾组织中TGF-β1高表达是DN肾功能恶化的经典途径之一。TGF-β1刺激细胞外基质的合成，诱使MCs的硬化，加速血浆蛋白从肾小球基底膜漏出到包氏囊，诱导下游肾小管区域促炎和促纤维化的损伤，从而介导肾小管的纤维化和萎缩[9]。然而，DN肾组织中TGF-β1升高的原因仍不完全清楚。既往研究表明，血流动力学因素、高糖环境、糖基化终末产物、糖基化终末产物受体上调是DN肾组织TGF-β1表达增加的重要原因，但是，纠正DN患者血液循环及降低血糖并不能有效降低DN肾组织TGF-β1表达，亦不能阻止DN的进一步恶化。因此高糖并不是导致TGF-β1表达增高的直接原因。本研究建立在大鼠系膜细胞体外培养的基础上，观察高糖对系膜细胞的IL-18和TGF-β1 mRNA表达的影响。结果显示，高糖条件下不仅IL-18、TGF-β1表达均升高，并且TGF-β1表达升高依赖于IL-18的升高，两者存在剂量依赖性；通过IL-18 Ab阻断IL-18发现可以抑制TGF-β1的表达。由此我们推测在HBZY-1中，IL-18可以发挥调节因子作用，是TGF-β1的上游调控因子，对上调TGF-β1的表达有重要作用。因此通过IL-18抗体拮抗IL-18来阻断TGF-β1的表达，可以防止或减少DN炎症启动，进而有助于阻止DN的发生，是防治DN的有意义的新靶点。目前已有研究表明IL-18能通过与IL-18受体的结合激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号转导途径诱导TH1细胞产生IFN-γ、IL-2等细胞因子；基于此研究结果，本课题组将继续对IL-18与TGF-β1的信号通路及胞内途径及其蛋白表达作进一步深入研究。

综上所述，本研究显示高糖可以导致IL-18表达升高，IL-18可以诱导肾小球系膜细胞TGF-β1高表达，启动DN肾脏炎症。该结果进一步阐明了DN炎症启动及进展的免疫学机制，为IL-18抗体治疗DN提供理论依据，为DN防治策略提供新的思路。

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