2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉对大鼠脑缺血再灌注损伤后Bcl-2和Bax表达的影响

2012-01-05 03:41杨金龙程朝辉刘双韩钊侯圣陶
温州医科大学学报 2012年2期
关键词:暗带咪唑阳性细胞

杨金龙,程朝辉,刘双,韩钊,侯圣陶

(温州医学院附属第一医院,浙江 温州 325000,1.脑血管科;2.神经生物研究所)

2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉〔2-(2-benzofuranyl)-2-imidazoline,2-BFI〕是1996年由Lione等[1]首次报道的一种新的、有选择性的、高亲和力的咪唑啉I受体(imidazoline receptor,IR)的配体。有报道称,脑缺血再灌注损伤后早期给予2-BFI可以减轻神经功能缺损,缩小脑梗死灶的体积,减少缺血半暗带神经细胞凋亡[2]。但2-BFI抗凋亡作用的具体机制尚不清楚。本研究用SD大鼠脑缺血再灌注损伤模型,于缺血再灌注后立即静脉给予2-BFI进行干预,观察其对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响,探讨2-BFI对大鼠缺血性再灌注脑损伤的抗凋亡作用的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康的雄性SD大鼠36只,二级动物,3~4月龄,体质量240~280 g,由温州医学院实验动物中心提供,合格证号:SCXK(沪)2007-0005。大鼠术前自由进食饮水,饲养环境保持安静,日光采光,光暗周期为12 h,饲养环境温度为18~22℃。大鼠在造模前12 h禁食但不禁水。整个实验过程中对于动物的饲养、用药、手术及取材均严格遵循实验动物科学管理的有关规定。

1.2 主要药品与试剂 2-BFI(英国Tocris公司);Bcl-2抗体和Bax抗体(美国Santa公司);兔二步免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司)。

1.3 脑缺血再灌注模型的建立 参照Longa等[3]和Koizum等[4]的线栓法,稍加以改进,以左侧为栓塞侧。栓线采用尼龙鱼线,长2.5 cm,前端烧灼并涂以薄层石蜡。线栓插入深度为距颈总动脉分叉处(1.85±0.05)cm,堵住大脑中动脉的起始部,在操作过程中,肛温保持在36~37 ℃。术中适时用温0.9%氯化钠溶液浸润术野,以防术野干燥,并观察动物的生命体征是否平稳。于术后120 min拔出线栓。假手术组分离颈总和颈内、颈外动脉,并结扎颈总和颈外动脉,但不插入线栓。

1.4 实验分组及给药方法 24只大鼠,按完全随机法分为假手术组、模型组、用药组,每组各8只。大脑中动脉栓塞建模成功后,在动物清醒后行Longa 5分法[3]评分,1~3分的入组,并于手术后120 min时拔线,完成缺血再灌注模型。用药组于拔线后立即经尾静脉注射3 mg/kg的2-BFI,假手术组、模型组经尾静脉注射相同体积的0.9%氯化钠溶液。

1.5 标本采集 所有动物于用药24 h后经神经功能评分后麻醉,各组经心脏灌注后断头取脑后固定于4%多聚甲醛中浸泡24 h,而后冲水24 h,石蜡包埋备用。

1.6 Bcl-2、Bax蛋白的检测 石蜡切片脱蜡、水化。纯化水冲洗,PBS浸泡,高压抗原修复后,依据试剂盒中的说明书,对Bcl-2、Bax蛋白用免疫组织化学技术进行检测。光镜下观察,每张取5个视野,计数Bcl-2、Bax阳性细胞数,取其平均值。1.7 统计学处理方法 计量资料以±s表示,用SPSS17.0软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

Bcl-2、Bax阳性细胞呈棕黄色,胞浆染色。假手术组偶见Bcl-2阳性细胞,模型组和用药组Bcl-2阳性细胞明显增多,且用药组与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01)。假手术组偶见Bax阳性细胞,模型组Bax阳性细胞明显增多,2-BFI用药组Bax阳性细胞明显减少且与模型组相比有明显差异(P<0.01),见图 1、表1。

表1 各组脑组织Bax和Bcl-2阳性细胞数(n=8,±s)

图1 各组脑组织免疫组化Bcl-2阳性细胞和Bax阳性细胞的表达(DAB,×400)

3 讨论

脑缺血再灌注损伤引发神经系统功能失调和障碍,缺血中心区域的神经元由于急性缺血低氧而迅速坏死,缺血半暗带中一些细胞则会经过一段时间后慢慢死亡,形态学研究发现,这些细胞的死亡常常呈现出凋亡的特征。在整个凋亡过程,诸多原癌基因及其肿瘤前体基因参与其中,如p53、Bcl-2、Bax等。

目前普遍认为,Bcl-2是一种膜整合蛋白,主要分布在核膜(尤其是核孔复合体处)、线粒体、内质网及核周围的膜性结构上,通过参与核内外物质的交换,在一定程度上抑制细胞色素C从线粒体上的释放,减少钙离子的释放,阻断细胞内过氧化物堆积,因此Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用。Linnik等[5]发现Bcl-2过表达能够对抗脑缺血后的损伤,在局灶性脑缺血损伤后的大脑皮层中可见大量的Bcl-2阳性细胞,增加内源性Bcl-2的表达有利于受损细胞的存活,反之则加重脑组织的损伤。Cao等[6]以脂质体为载体,将人源性的Bcl-2导入局灶脑缺血后的大鼠的脑内,发现梗死灶明显减小,半暗带的细胞凋亡亦明显减轻。Bax又称Bcl-2 相关蛋白X,是一种Bcl-2家族的前凋亡蛋白,分子量为20~26 kD,由192个氨基酸残基组成,一般存在于细胞浆中。当细胞受到损伤或刺激后,它能起到传感器的作用,可以重新定位于线粒体的表面并拮抗Bcl-2的功能。也有研究认为Bax可以通过与通透转变孔蛋白共同作用,致使细胞色素C释放,从而起到了促进细胞凋亡的作用。缺血脑组织中的Bax蛋白表达减少,对脑有一定的保护作用[7-8]。本实验也发现Bax蛋白参与缺血后细胞凋亡,阳性细胞多位于缺血半暗带区,用药组阳性细胞明显少于模型对照组(P<0.01),说明2-BFI能降低Bax蛋白的表达,对脑缺血再灌注有保护作用。

我们以往的研究发现咪唑啉I2受体(I2R)高亲合力配体2-BFI对星形胶质细胞糖氧剥夺损伤具有保护作用,抑制脂质过氧化可能是其保护机制之一[9],在脑缺血再灌注损伤大鼠模型给予2-BFI,能抑制细胞凋亡,表现出抗凋亡作用[10]。本实验发现,在脑缺血再灌注后立即经尾静脉给以2-BFI,不仅可以上调Bcl-2蛋白的表达,还能下调Bax蛋白的表达。这表明2-BFI对脑缺血再灌注损伤后的抗凋亡作用与2-BFI可以上调抗凋亡因子Bcl-2的表达和下调Bax蛋白的表达有关。

[1] Lione LA, Nutt DJ, Hudson AL. [3H]2-(2-benzofuranyl)-2-imidazoline: a new selective high affinity radioligand for the study of rabbit brain imidazoline I2receptors[J].Eur J Pharmacol,1996,304(1-3):221-229.

[2] Han Z, Xiao MJ, Shuo B, et al. Attenuation of ischemiainduced rat brain injury by 2-(-2-benzofuranyl)-2-imidazoline,a high selectivity ligand for imidazoline I2 receptors[J].Neurol Res,2009,31(4):390-395.

[3] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[4] Koizumi J, Yoshida Y, Nakazawa T, et al. Experimental studies of ischemic brain edema: a new experimental model of cerebral embolism in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J].Jpn J Stroke,1986,16(8):1-8.

[5] Linnik MD, Zahos P, Geschwind MD, et al. Expression of bcl-2 from a defective herpes simplex virus-1 vector limits neuronal death in focal cerebral ischemia[J].Stroke,1995,26(9):1670-1675.

[6] Cao YJ, Shibata T, Rainov NG. Liposome- mediated transfer of the Bcl-2 gene results in neuroprotection after in vivo transient focal cerebral ischemia in an animal model[J].Gene Ther,2002,9(6):415-419.

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[9] 田继沙,韩钊,张红霞,等.2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉对星形胶质细胞糖氧剥夺损伤的保护及抗脂质过氧化作用 [J]. 温州医学院学报,2010,40(6):560-563.

[10] Han Z, Zhang HX, Tian JS, et al.2-(-2-benzofuranyl)-2-imidazoline induces Bcl-2 expression and provides neuroprotection against transient cerebral ischemia in rats[J].Brain Res,2010,1361:86-92.

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