白藜芦醇／β－环糊精包裹物清除过氧亚硝基作用研究

吕 中，黄慧芳，赵慧平，洪 岱，杨 浩，陈 嵘

（武汉工程大学 绿色化工过程教育部重点实验室 湖北省新型反应器与绿色化学工艺重点实验室，武汉 430073）

白藜芦醇／β－环糊精包裹物清除过氧亚硝基作用研究

吕 中，黄慧芳，赵慧平，洪 岱，杨 浩，陈 嵘＊

（武汉工程大学 绿色化工过程教育部重点实验室 湖北省新型反应器与绿色化学工艺重点实验室，武汉 430073）

抗肿瘤、抗心血管疾病药物白藜芦醇（Resveratrol，Res）由于难溶于水、不稳定而限制了其广泛应用，采用β－环糊精（β－cyclodextrin，β－CD）包裹可克服上述缺陷.研究结果表明随着β－CD浓度增大，Res的水溶性明显增加，Res与β－CD形成包裹物的化学计量比为1∶1.体外实验证实Res／β－CD包裹物可清除具有强氧化与硝化性的过氧亚硝基ONOO－，低温有利于清除反应的进行，CO2的存在减少与ONOO－反应的Res／β－CD包裹物量.

白藜芦醇；β－环糊精；包裹物；过氧亚硝基

环糊精（Cyclodextrin，CD）是一种水溶性、非还原性、不易被酸水解的白色晶体，无毒，可食用，由环糊精糖基转移酶作用于淀粉而形成的一类环状低聚糖.常见的CD是由6～8个葡萄糖单元以1，4－糖苷键结合而成的 α－CD、β－CD 以及 γ－CD 3种.CD分子呈锥形的圆环结构，外壁为亲水性，内部的疏水性空腔可以作为受体借助分子间相互作用包裹各种无机及有机分子形成包裹物，以改变这些化合物的物理化学性质及降低它们的不稳定性.目前CD包裹物已广泛应用于制药、分析化学、环保、有机合成、食品等诸多领域［1-2］.β－CD与其它天然的CD及化学改性的CD相比，具有空腔大小合适、包裹能力较高、生产成本低、来源广等优点，成为目前应用得最为广泛的CD产品.

白藜芦醇（Resveratrol，Res）化学名为3，4’，5－三羟基二苯乙烯，是植物在遇到不利条件下自然产生的抗毒素，在葡萄、虎杖和花生等72种植物中存在，其中新鲜葡萄皮中的含量最高［3］.红酒中Res的含量可达1.5～3mg／L，是其可降低心血管疾病死亡率的直接原因［4］.随着对 Res研究的深入，人们发现它具有多种药理活性，如调节脂蛋白代谢，抑制低密度脂蛋白氧化［5］；抑制血小板聚集和减少前列腺素的产生等［6］.Res真正引起人们的广泛关注是在1997年Jang等在Science上较系统地报道了Res的抗肿瘤作用［7］，对其抗肿瘤作用的研究逐渐成为Res研究的热点.

Res疏水性强，在水中几乎不溶解，对空气、光、氧化剂敏感，且代谢及排泄速度快［8］，严重影响了其在临床上的广泛使用.用CD包裹Res形成水溶性的包裹物可克服上述缺陷.

到目前为止，有关Res／CD包裹物的研究报道大部分集中在包裹物的表征和包裹过程动力学及热力学参数的确定［9-12］，有关包裹物的生物活性报道较少.Lucas－Abellán测定了 Res／CD 包裹物对氧自由基的清除活性［13］，Berta报道了含 Res／HPCD的泡沫和漱口水可显著抑制仓鼠口腔鳞状细胞癌的增殖［14］，本课题组报道了Res／CD包裹物清除DPPH自由基活性［15］.

过氧亚硝 基阴离子（Peroxynitrite anion，ONOO－）存在于人体内皮细胞、神经细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞［16］，其强氧化及硝化特性可引起细胞内DNA、蛋白质及脂等大分子的损伤，使细胞的代谢发生障碍及能量耗竭，导致细胞凋亡、损伤，甚至死亡.本课题组曾报道Res具有清除ONOO－引起的DNA损伤［17］，及 Res／羟丙基－β－环糊精（hydroxypropyl－β－CD，HP－CD）包裹物能清除ONOO－［18］.由于β－CD比 HP－CD价廉且易得，因而采用β－CD包裹Res制得包裹物比采用 HP－CD更有优势.本研究采用β－CD包裹 Res，对 Res／β－CD包裹物与ONOO－的反应进行研究，并考查温度及CO2对反应的影响，以期为Res／β－CD包裹物的应用提供一定的实验基础.

1 实验部分

1.1 材料与仪器

Res（99%），购自 Sigma公司；β－CD，二乙烯三胺五乙酸（DTPA）购自国药.

ONOO－合成：由亚硝酸钠和酸性 H2O2按文献［19］合成，过量的 H2O2用 MnO2除去（6mg／mL，4℃，30min），过滤除去多余的 MnO2.合成的ONOO－原液在－20℃ 保存，临用前用4mmol／L NaOH稀释，浓度由302nm的吸光值计算（ε＝1670L· mol－1·cm－1）.

其它试剂均为国产分析纯，实验用水为超纯水.

Perkin Elmer Lambda 35紫外／可见分光光度计（美国）.

1.2 Res与β－CD相互作用的紫外光谱

Res溶于50%二甲基亚砜中配成50mmol／L原液，避光保存在4℃冰箱.将25μmol／L的 Res与不同浓度的β－CD相混合，25℃振荡4h，在240～400nm范围测量Res与不同浓度β－CD混合后溶液的紫外光谱.

1.3 相溶解性实验

［20］，过量固体Res加入不同浓度的β－CD水溶液中，25℃ 下振荡24h，为防止Res的光化学降解，离心管用锡纸包裹.平衡后样品用0.45μm滤膜过滤以除去未溶解的Res固体.Res的溶解量用紫外光度计测量.

包裹物的结合常数KC（stability constant）由相溶解度图按Higuchi－Connors方程计算：

S0为Res在25℃ 时水中的溶解度，斜率为相溶解度图中相应曲线的斜率.

1.4 Res／β－CD 包裹物与过氧亚硝基作用

Res／6mmol／Lβ－CD 包裹物（6mmol／Lβ－CD包裹Res所形成的包裹物）200mL与ONOO－（浓度分别为0、20、40、60、80、100、120、140 μmol／L） 在 25℃、pH 6.9 缓 冲 溶 液（50mmol／L 磷 酸 盐、0.1mmol／L DTPA、10mmol／L NaCl）中进行反应，ONOO－的加入不改变反应体系的pH.在实验条件下ONOO－自分解的半衰期不到2s［21］，因此加入ONOO－的同时须剧烈搅拌溶液.Res／6mmol／Lβ－CD 包裹物在306nm处有最大吸收峰，而 ONOO－在pH 6.9缓冲液中快速分解后，在此无吸收峰.通过测定306nm处的光吸收变化来检测反应剩余的Res／6mmol／Lβ－CD包裹物.反应5min后用紫外／可见分光光度计记录光谱变化.

2 结果与讨论

2.1 Res与β－CD相互作用的紫外光谱

如图1所示，β－CD在测量范围内没有光吸收，Res在304nm处有最大吸收峰，加入β－CD后其最大吸收峰红移约2nm，说明Res与β－CD发生了包裹作用.

图1 Res与β－CD相互作用的紫外可见光谱Fig.1 UV－vis spectrum of Res withβ－CD interaction

将25μmol／L Res加入不同浓度的β－CD溶液中，测得的最大吸收峰、吸光值及由朗伯－比尔定律计算所得的消光系数ε见表1.

表1 Res与β－CD相互作用的紫外数据Tab.1 The UV－vis data of Res withβ－CD interactions

由表1中数据，取306nm处β－CD存在时的消光系数平均值40.83×103L· mol－1·cm－1确定Res／β－CD包裹物中Res的浓度.

2.2 相溶解性实验

将溶解的Res浓度对相应的β－CD浓度作图，结果见图2.Res浓度随β－CD浓度增加呈线性增加，说明 Res与β－CD形成的包裹物分子比为1∶1［20］，与 Res／HP－CD包裹物分子比相同；Res与β－CD的结合常数由式（1）计算为1815L·mol－1，小于Res与 HP－CD 结合常数［18］.

图2 Res在β－CD中的相溶解性图（25℃）Fig.2 Phase－solubility diagram of Res inβ－CD solution

2.3 Res／β－CD包裹物与过氧亚硝基相互作用

Res／6mmol／Lβ－CD包裹物与ONOO－ 在pH 6.9条件下相互作用的紫外光谱见图3.ONOO－在pH 6.9缓冲液中快速分解，测量范围内无吸收峰.随着加入包裹物中ONOO－浓度不断增大（0～140μmol／L），溶液的吸收值不断降低，即包裹物浓度不断降低.当ONOO－在缓冲液中预先分解，再加入Res溶液中，则Res光谱不发生变化（数据未显示）.

图3 Res／6mmol／Lβ－CD包裹物与 ONOO－作用的紫外可见光谱Fig.3 UV－vis spectrum of Res／6mmol／Lβ－CD with ONOO－reaction

由 Res与 ONOO－ 的反应机理［17］，可推断Res／β－CD包裹物与ONOO－可能的反应机理：

2.4 温度对Res／β－CD包裹物与过氧亚硝基相互作用影响

25℃、37℃ 及 50℃ 时 Res／6mmol／Lβ－CD包裹物与ONOO－的反应结果见图4.

图4 温度对 Res／6mmol／Lβ－CD 包裹物与ONOO－反应的影响Fig.4 Effects of temperature on the reaction of Res／6mmol／Lβ－CD with ONOO－

由图4可知，随着温度升高，包裹物的光吸收值不断增大，即体系中未反应的包裹物增加.当ONOO－浓度为80μmol／L时，温度从25℃ 升到50℃ 时，未反应的包裹物量增加67%，说明包裹物与ONOO－的反应是放热反应，低温有利于反应的进行，这与Res／HP－CD包裹物与ONOO－反应的特点相同［18］.

2.5 CO2对Res／β－CD包裹物与过氧亚硝基相互作用影响

在血液中CO2浓度高达1.3mmol／L，为考查CO2的存在对Res／6mmol／Lβ－CD包裹物与ONOO－反应的影响，测定了在含25mmol／L碳酸盐（与1.3mmol／L CO2相平衡）的缓冲液中 Res／6mmol／Lβ－CD 包裹物与 ONOO－反应，结果见图5.

图5 CO2 对Res／6mmol／Lβ－CD包裹物与ONOO－反应的影响Fig.5 Effects of CO2on the reaction of Res／6mmol／Lβ－CD with ONOO－

由图5可知，当缓冲液中含碳酸盐时，未反应的包裹物增加.CO2的存在对ONOO－的影响有两方面：一是使ONOO－的半衰期从700ms变为12 ms；二是与ONOO－反应，生成寿命更短的中间物ONOOCO2－，有约35%的中间物分解为·NO2和CO3·－自由基［22］，在此条件下包裹物与ONOOCO2－ 分解产生的CO3·－发生反应.由于CO3·－的反应活性不如ONOO－，因此未反应的包裹物量增加.

3 结论

β－CD可提高Res的水溶性，包裹后的Res同样具有抗ONOO－作用，低温有利于清除反应的进行.相比于其它CD，β－CD来源广、价格低，更适合用于包裹 Res.而Res／β－CD包裹物可在治疗由ONOO－引起的一系列疾病中发挥作用.

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Study on the reaction of Res／β－CD inclusion complex with peroxynitrite

LV Zhong，HUANG Huifang，ZHAO Huiping，HONG Dai，YANG Hao，CHEN Rong
（Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education，Hubei Novel Reactor ＆ Green Chemical Technology Key Laboratory，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430073）

The utilization of anticancer and anticarcinogenesis drug resveratrol（Res）is limited by its poor solubility and stability.The limitation could be overcome by the formation of inclusion complexes withβ－cyclodextrin（β－CD）.The investigate results show that the solubility of Res increasing with increasedβ－CD concentration，the stoichiometric ratio of Res withβ－CD in the complex is 1∶1.The in－vitro experiment conforms that the Res／β－CD inclusion complex can reacts to peroxynitrite，which has strong oxidation and nitration.Lower temperature is benefits the above reaction.The existence of CO2can reduce the quantity of the Res／β－CD inclusion complex which reacts with peroxynitrite.

resveratrol；β－cyclodextrin；inclusion complex；peroxynitrite

Q754

A

1000－1190（2012）02－0180－04

2011－08－10.

武汉市科技局对外科技合作与交流计划（201171034319，201070934342）；武汉工程大学青年科学基金项目（Q201104）；武汉工程大学“环境与化工清洁生产实验教学示范中心”创新型实验项目.

＊通讯联系人.E－mail：rchenhku＠hotmail.com.