黄芪多糖对力竭运动大鼠心肌细胞凋亡及BcL－2、Bax蛋白表达的影响

马兰军，田振军

（1.西安建筑科技大学 体育系，西安 710055；2.陕西师范大学 体育学院，西安 710062）

黄芪多糖对力竭运动大鼠心肌细胞凋亡及BcL－2、Bax蛋白表达的影响

马兰军1＊，田振军2

（1.西安建筑科技大学 体育系，西安 710055；2.陕西师范大学 体育学院，西安 710062）

为了探讨黄芪多糖（APS）对力竭运动大鼠机体的保护作用，通过建立大强度力竭运动大鼠模型，选取成年健康雄性SD大鼠24只，随机分为安静对照组，运动组和运动加药组，运动组和运动加药组按照训练模型进行为期6周的耐力训练，最后1次训练进行1次力竭运动，随后取心肌组织并进行样本处理.检测大鼠心肌MDA含量，用缺口末端标记法（TUNEL法）及免疫组织化学法检大鼠心肌细胞凋亡指数（AI）及BcL－2、Bax蛋白表达的变化.结果表明：运动组MDA含量、AI和BcL－2、Bax蛋白表达水平均明显高于安静对照组（P＜0.05）；与运动组比较，运动加药组 MDA含量，AI与Bax蛋白表达水平均下降，而BcL－2蛋白表达水平显著增高（P＜0.05）.黄芪多糖可有效抑制力竭运动大鼠心肌细胞凋亡，此作用可能与其减轻氧化应激、上调BcL－2和下调Bax蛋白表达水平有关.

黄芪多糖；力竭运动；心肌；细胞凋亡；BcL－2蛋白；Bax蛋白

大强度急性力竭运动过程中，随着运动强度的增加导致机体血液重新分布，心脏血流急骤下降，同时由于能量物质耗竭、代谢产物堆积及氧化应激所造成的自由基损伤等多种因素的影响，机体运动能力下降，出现运动性疲劳，从而引起体细胞凋亡.心肌是终末分化细胞，故一定程度的细胞凋亡可能会使心肌遭受严重的损伤并导致永久性的功能障碍.如何避免心肌损伤己成为运动医学领域的一项重要研究内容.

黄芪为豆科植物膜荚黄芪及蒙古黄芪的根，近年来的研究发现黄芪中含多糖、皂苷、黄酮、氨基酸等多种有效成分，其中黄芪多糖（APS）经过高科技萃取、分离而得到，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用［1-2］.但黄芪多糖对急性力竭运动大鼠心肌细胞是否有保护作用研究不多.本研究旨在采用急性大强度力竭运动大鼠心肌细胞损伤模型，观察其对心肌细胞凋亡调控基因BcL－2、Bax的变化，探讨黄芪多糖对力竭运动大鼠心肌细胞保护作用及可能的作用机制，为中医药在临床上防治心肌缺血、缺氧性疾病和抗运动疲劳的作用提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 实验对象及分组

健康雄性SD大鼠（购于陕西中医研究所）24只，3月龄，体重252±13g，所有动物按国家标准啮齿类动物饲料分笼饲养，每笼6只，自由饮食饮水.室温控制在18℃～23℃，相对湿度40%～60%，自然光照.实验室隔天用消毒液消毒.将24只大鼠随机分为3组：安静对照组（安静组）、大强度耐力运动组（运动组）、大强度耐力运动＋黄芪多糖组（运动加药组），每组8只，安静组和运动组每天灌胃生理盐水0.1mL／10g，1次，运动加药组每天灌胃黄芪多糖（购于长沙绿康生物制品有限公司）0.1mL／10g，1次，实验时间6周.

1.2 力竭运动模型

实验动物正式实验前，在国产跑台上作5min的适应性训练（速度8.2m／min坡度为0）.正式实验时，运动组和运动加药组大鼠采用Benford［3］根据大鼠体重／摄氧量回归方程建立递增负荷跑台运动疲劳模型，训练持续6周，每周6d，周日休息.先进行1周适应性训练，逐渐提高运动强度至80%VO2max以上，最后1d运动至力竭（表1）.运动时用声光刺激或者用毛刷刺激动物尾部，使动物保持在跑台前部1／3处，以保证运动强度.力竭判断标准：动物未能坚持原跑速，跑的姿势由开始时的蹬地跑变为半卧位跑，腹部与跑道时有接触，甚至为卧位跑，到运动末期，大鼠先后滞留跑道后1／3处达3次以上，各种刺激驱赶均无效，停跑后体征表现为呼吸急促、神情倦怠、腹卧位，对刺激反应迟钝，捕捉时逃避反应较运动前减弱［4-5］.

表1 实验动物运动方案Tab.1 Experimental animal movements scheme

1.3 实验仪器与试剂

1.3.1 实验仪器 SHH·W21·600三用电热恒温水箱，UV－9200紫外可见光光度计，TGL－16C台式高速离心机，PT动物电动跑台，820轮转组织切片机（美国AO公司）；鼠源Bax一抗和鼠二抗（武汉博士德生物工程有限公司）；OLYMPUSBX52显微照相图像采集系统（日本奥林巴斯株式会社）.

1.3.2 取材及样品制备 在运动期的最后1d，安静组大鼠用20%乌拉坦（0.5mL／kg体重）腹腔麻醉后，打开胸腔，立即取出心脏待用.运动组和运动加药组大鼠进行一次性力竭运动，在力竭运动后即刻麻醉处死，取材待用（方法同安静组）.

心肌线粒体悬液的制备：采用差速离心法.取大鼠心肌用介质Ⅰ（0.125mol／L蔗糖溶液，3.0mmol／L n－2－羟乙基呱嗪－n－2－乙磺酸，0.5mmol／L乙二胺四乙酸，pH＝7.4）冲洗净血污，剔除结缔组织，剪碎，加20mL介质电动匀浆器匀浆，放入离心管中离心，2 500r／min，5min，取上清液于12 000r／min离心，10min，沉淀用介质Ⅱ（0.25mol／L蔗糖溶液，2.0mmol／Ln－2－羟乙基呱嗪－n－2－乙磺酸，0.5mmol／L 乙二胺四乙酸，pH＝7.4）悬浮，手动匀浆器匀浆，加入2mL介质Ⅱ，12 000r／min离心，10min，沉淀悬浮在0.5mL介质Ⅱ中，制备成线粒体悬液.

1.4 测试指标及方法

1.4.1 测试指标 BCA法蛋白定量试剂盒和MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所）；细胞凋亡检测试剂盒POD（No.MK1020，武汉博士德生物工程有限公司）；抗BcL－2多克隆抗体；抗Bax多克隆抗体.

1.4.2 测定方法 心肌 MDA含量测定：切取左室全层心肌，4℃，10%匀浆，低温离心取上清，－70℃冻存.按试剂盒说明，采用bicinchoninicacid（BCA）法进行蛋白定量，硫代巴比妥酸法测MDA含量.

心肌细胞凋亡、BcL－2和Bax蛋白表达测定：切取2.5mm厚全层心室肌，4%多聚甲醛固定16～20h，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5μm.用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测凋亡晚期特征性的细胞核DNA片段，以试剂盒提供的阳性对照片作为阳性对照，操作过程用PBS代替脱氧核糖核酸末端转移酶作为阴性对照.凋亡细胞的细胞核为深浅不一的棕黄色或棕褐色，非凋亡细胞呈蓝色.采用链霉亲和素－生物素－过氧化物酶复合法检测心肌细胞BcL－2与Bax的蛋白表达.在阴性对照操作中不加抗BcL－2和抗Bax抗体.蛋白阳性表达细胞的胞质呈棕黄色或棕褐色，细胞核蓝染.将TUNEL与免疫组切片于光镜下400倍放大，数码相机拍摄，图像经OLYMPUSBX52图文分析系统分析，每张切片随机选择10个视野，测定阳性染色的平均吸光度（A）和阳性细胞百分比，计算细胞凋亡指数（apoptotic index，AI）：AI（%）＝平均吸光度×阳性细胞百分比.

1.5 统计学处理

所有数据运用SPSS12.0for Windows软件包进行处理.统计学方法采用单因素方差分析（One－Way ANOVA）.实验结果以均数±标准差（X±S）.显著性差异选择P＜0.05和P＜0.01.

2 结果

2.1 黄芪多糖对急性力竭运动大鼠心肌细胞MDA含量的影响

表2结果显示，运动组比安静对照组心肌MDA含量明显增高，运动加药组比运动组MDA含量明显降低（P＜0.05）.

2.2 黄芪多糖对急性力竭运动大鼠心肌细胞凋亡的影响

表2结果显示，TUNEL检测结果显示安静对照组凋亡细胞极少，运动组凋亡细胞明显增多，运动加药组比运动组凋亡显著降低（P＜0.05）.

2.3 黄芪多糖对急性力竭运动大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白BcL－2、Bax表达的影响

表2结果显示，安静对照组中BcL－2、Bax蛋白表达水平较低；运动组与安静对照组相比，BcL－2、Bax蛋白表达均明显增加（均P＜0.05）；与运动组比较，运动加药组BcL－2蛋白表达明显增加，Bax蛋白表达显著降低（均P＜0.05）.

表2 各组大鼠心肌MDA含量、AI和BcL－2、Bax平均吸光度值（X±S，n＝8）Tab.1 The rat myocardial MDA content，AI and Bcl－2，Bax awerage absoroance valne（x±s，n＝8）

3 分析与讨论

在急性力竭运动中会伴有大量心肌细胞凋亡，从而加重了心肌的破坏，这与力竭所致的氧自由基及细胞内钙超载有关［6］.

实验利用大鼠运动力竭模型，研究黄芪多糖对运动力竭大鼠心肌细胞凋亡及BcL－2、Bax蛋白表达的影响.结果显示APS可明显减轻因运动力竭导致的心肌细胞凋亡，BcL－2蛋白表达增高、Bax蛋白表达降低，同时MDA的含量降低.

研究证实，APS具有抗自由基损伤，保存胞内ATP含量，减轻钙超载等多种生物学效应［7］.实验中APS有减少心肌细胞凋亡的作用，这可能与其抗自由基的作用有关.氧自由基可直接造成DNA损伤或激活凋亡发生过程的关键物质而诱发细胞凋亡［8］；除此之外，氧自由基通过使还原物质耗竭及合成受阻而改变胞内氧化还原状态，修饰刺激信号或活化与凋亡有关的关键蛋白等间接方式来诱导凋亡.氧自由基还会以间接方式介导细胞凋亡，其中涉及线粒体、蛋白激酶、转录因子等多信号转导途径.MDA是脂质过氧化的终产物，其含量间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度［9-10］.本实验进一步说明APS具有明显的抗自由基作用.

BcL－2家族蛋白在细胞凋亡过程中具有双向调节作用.在生理条件下，细胞有序而协调地激活凋亡诱导基因和凋亡抑制基因共同控制着细胞代谢功能，维持细胞内环境的动态平衡.Bax是一种促凋亡基因，含有BH1到BH3 3个结构域，分布于线粒体外膜，通过作用于线粒体引起细胞凋亡.Bax蛋白以非活性形式存在于胞质中，在凋亡诱导因素作用下发生构型变化，从细胞质移位到线粒体膜与BcL－2形成异源二聚体抑制BcL－2的活性，使mPTP不可逆开放，启动和维持细胞凋亡的“线粒体途径”.而BcL－2是一种凋亡抑制基因，BcL－2和Bax的比率可决定细胞对凋亡信号的敏感性.BcL－2蛋白具有稳定mPTP的作用，使mPTP的功能保持正常［11］.BcL－2蛋白分布于线粒体外膜的浆膜面、内质网及核膜.它含有BH1到BH4 4个结构域，具有稳定线粒体膜的功能，阻止线粒体释放caspase及活性因子 AIF、Cyt c等.BcL－2能抑制Bax和Bad等从胞质向线粒体膜的移位；抑制Bax形成异源二聚体和寡聚体，抑制Bax与VDAC的相互作用，阻断Bax的成孔活性.实验发现运动组大鼠心肌BcL－2和Bax蛋白表达均增高，这可能是心肌在力竭运动过程中损伤和抗损伤相互拮抗的一种表现，BcL－2受到某种抑制因素的作用，使Bax促凋亡作用最终占优从而导致心肌细胞凋亡［12］.APS能够减少因运动力竭所致的心肌细胞凋亡，其作用的机制可能与抗自由基损伤、上调BcL－2和下调Bax蛋白表达有关，至于其具体的分子机制或信号传导途径尚需进一步深入研究.

［1］毛淑梅，李承德，王 琳，等.黄芪多糖对糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡作用及机制的研究［J］.中国药理学通报，2009，25（9）：1227－1229.

［2］尹艳艳，李卫平，王绍斌，等.黄芪提取物对大鼠局灶性脑缺血／再灌注损伤后炎症因子及细胞凋亡的作用［J］.中国药理学通报，2005，21（12）：1486－1489.

［3］Bedford T G，Tipton C M，Wilson N C，et al.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures［J］.J App Physiol，1979，47（6）：1278－1283.

［4］李善妮.急性力竭运动对大鼠肝细胞损伤及凋亡的影响［D］.长沙：湖南师范大学.2005.

［5］李善妮，翟树林，汤长发.急性不同强度至力竭运动对大鼠肝细胞凋亡的影响［J］.北京体育大学学报，2006，29（5）：634－636.

［6］金其贯，邓荣华.过度训练对大鼠心肌细胞凋亡的影响［J］.中国运动医学杂志，2000，19（4）：356－359.

［7］Mu Y L，Xie Y Y，Zhou L，et al Cardioprotective effect of methy lamine irisolidone，a new compound，in hypoxia／reoxygenation injury in cultured rat cardiacmyocytes［J］.Chem Biodivers，2009，6（8）：1170－1177.

［8］Danz E D，Skramsted J，Henry N，et al.Resveratrol prevents doxo－rubicin cardiotoxicity through mitochondrial stabilization and the Sirt1pathway［J］.Free Radic BiolMed，2009，46（12）：1589－1597.

［9］Coudray C，Pucheu S，Boucher F，et al.Effect of ischemia／reperfu－sion sequence on cytosolic iron status and its release in the coro－nary effluect in isolated rathearts［J］.Biol Trace Elem Res，1994，41（1－2）：69－75.

［10］Gao F，Gong B，Christopher T A，et al.Anti－apoptotic effect ofBe－nidipine，a long lasting vasodilating calcium antagonist，in ische－mic－reperfused myocardial cells［J］.Brit J Pharmacol，2001，7（9）：132－136.

［11］张 钧，许豪文.运动对细胞凋亡的影响（综述）［J］.体育学刊，2002，9（6）：45－48.

［12］杨连君，司晓辉，王文亮.凋亡相关蛋白Bax在肝细胞癌的表达及其意义［J］.诊断病理学杂志，2001，8（5）：282－284.

Effects of acute exercise to exhaustion on BcL－2，Bax gene of rat，sheart after supplyment of astragalus polysaccharide

MA Lanjun1，TIAN Zhenjun2
（1.Department of Physical Education，Xian University of Architecture ＆ Technology，Xian 710055；2.College of Physical Education of Sport，Shaanxi Normal University，Xian 710062）

To study the supplementary astragalus polysaccharide（APS）to exhaustion movement rats myocardial cell apoptosis，observe the influence of myocardial cell apoptosis BcL－2，the regulation of gene Bax changes，explore astragalus polysaccharide（APS）to exhaustion movement rats airframe of protection.By establishing high intensity exhaustion movement model of rats，the selection of adult health male SD rats 24 only randomly divided into quiet in the exercise group and control group，sports dosing group，the exercise group and exercise dosing groups according to training model sixweek endurance training，last training once exhaustion movement，exhaustion after motion myocardial organize and sample processing.Detection rats myocardial MDA content，using gap end labeling（TUNEL law）and the method of immunohis to chemistry methods were used by rats myocardial cell apoptosis I，ndex（AI）and BcL－2，Bax protein expression changes.In the exercise group MDA content，AI and BcL－2，Bax protein expression levels were significantly higher in quiet in control group（P ＜ 0.05）.Group compared with sports exercise dosing group MDA content，AI and Bax protein expression level decreased，and BcL－2protein expression levels rose significantly（P＜0.05）.Astragalus polysaccharide（APS）can restrain the movement exhaustion rats myocardial cell apoptosis，this function may reduce oxidatie stress，raised with BcL－2and cut Bax protein expression level concerned.

astragalus polysaccharide；exhaustion exercise；myocardial；apoptosis；BcL－2protein；Bax protein

Q956

A

1000－1190（2012）02－0214－04

2011－10－28.

国家科技部主任基金项目（31040045）；国家自然科学基金项目（31040045）.

＊E－mail：mlj8398＠sohu.com.