抗蛔虫人源单链抗体库的构建及鉴定

何光志，田维毅，高 英,王 平,王文佳,奚 锦,俞 琦,王乾宇，黄 高

(1.贵阳中医学院基础部，中国 贵阳 550002；2.遵义医学院附属医院，中国 遵义 563003)

蛔虫(AscarislumbricoidesLinnaeus, 1758)也称为人似蚓蛔虫，蛔虫病呈世界性分布，已经成为公共卫生问题之一[1]．据报道，全世界约有14.72 亿人感染蛔虫[2]．我国是蛔虫感染较严重的国家之一，近年全国人体重要寄生虫病现状调查资料显示，全国感染蛔虫人数为8 593万.蛔虫对群众健康和青少年儿童的生长发育危害较大[3]．

噬菌体抗体库技术是抗体工程领域的最重要进展，各种小分子抗体相继产生，在疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗等多个领域有着潜在的优势．该技术具有简单易行、生产成本低、筛选容量大等优点[4]．本研究采用噬菌体抗体库这一生物学技术构建抗蛔虫噬菌体展示单链抗体库，拟在为以后应用于蛔虫病的预防、诊断和治疗方面奠定基础．

1 材料与试剂

1.1 主要试剂

淋巴细胞分离液，购自为天津灏洋生物制品公司；逆转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，GIBCOBRL公司产品；pCANTAB-5E、辅助噬菌体M13K07、大肠杆菌E.coliTG1、HRP /抗M13 单克隆抗体，HRP/抗M13噬菌体单克隆抗体，Amersham Biosciences公司产品；DNA Ladder, Sigma公司产品；M13K07，Amersham Biosciences公司产品; DNA Purification System，Promega 公司产品；总RNA抽提试剂盒，购自上海华舜生物工程有限公司；SfiI和NotI限制性内切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶，购自大连宝生物公司；其他试剂均为国产分析纯．

SB培养液：35 g胰蛋白胨，20 g酵母提取物，5 g氯化钠，搅拌溶解，调pH至7.5，加水至1 000 mL，高压消毒; SOB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物2.5 g，NaCl 0.5 g，7.5 g琼脂粉，搅拌混匀加入500 mL水中，高压蒸汽灭菌，待冷却到50～60 ℃时，加入5 mL 1 mol/L MgCl2、 227.8 mL 2 mol/L葡萄糖(已抽滤灭菌)、5 mL 20 g/L氨苄青霉素(已抽滤灭菌)，迅速倒板；2×YT培养基：称取胰蛋白胨17 g，酵母提取物10 g，NaCl 5 g，搅拌混匀后加入1 L水中, 高压蒸汽灭菌，4 ℃保存; 2×YT-AK培养液：2×YT培养液含100 mg/L氨苄青霉素，50 mg/L卡那霉素; 2×YT-AG培养液：2×YT培养液含100 mg/L氨苄青霉素和质量分数为2%的葡萄糖．

1.2 材料

抗蛔虫阳性血清、蛔虫虫卵可溶性抗原，由贵阳中医学院棉靴实验室制备并保存．

2 方法

2.1 人外周血淋巴细胞的分离、总RNA 的提取和反转录

无菌取新鲜患有蛔虫病人外周血，将血样与PBS 缓冲液混合，然后缓缓加入人淋巴细胞分离液， 血样、PBS、人淋巴细胞分离液的体积比为1∶1∶1，进行2 000 r/min离心15 min，提取中间层淋巴细胞并进行计数，细胞数达到107，按总RNA 抽提试剂盒说明书操作抽提RNA，以抽提的总RNA为模板，以Oligo dT(18)为反转录引物，按照逆转录试剂盒手册进行．反转录的cDNA通过琼脂糖凝胶电泳检测结果．

2.2 人源抗体VH和VL基因的PCR 扩增

引用文献[5]中报道的引物, 上游引物：VH1af：5′-ACTG CGG CCC AGC CGG CCC AGG TGC AGC TGG TGC AGT CTG G-3′,VH2af：5′-ACT GCG GCC CAG CCG GCC CAG GTC AAC TTA AGG GAG TCT GG-3′,VH3af：5′-ACT GCG GCC CAG CCG GCC CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG-3′,VH4af：5-ACT GCG GCC CAG CCG GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCT GG-3′,VH5af：5′-ACT GCG GCC CAG CCG GCC CAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GG-3′,VH6af：5′-ACT GCG GCC CAG CCG GCC CAG GTA CAG CTG CAG GAG TCA GG-3′,scFvf： 5′-ATC GAC GCT ACT GCG GCC CAG CCG GCC CAG GT-3′, 下划线部分为SfiⅠ酶切位点．对应的下游引物(scFvf对应两条下游引物):Jκ1r：5′-GCG TCA GAG TGC GGC CGC ACG TTTG ATT TCC ACC TTG GTC CC-3′,Jκ2r：5′-GCG TCA GAG TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC-3′,Jκ3r： 5′-GCG TCA GAG TGC GGC CGC ACG TTT GAT ATC CAC TTT GGT CCC-3′,Jκ4r：5′-GCG TCA GAG TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAC CTT GGT CCC-3′,scFvr1：5′-ACG GCT GCG TCA GAG TGC GGC CGC ACG TTT-3′;Jλ1r：5′-GCG TCA GAG TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT GAC CTT GGT CCC-3′,Jλ2r：5′-GCG TCA GAG TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC-3′，Jλ3r：5′-GCG TCA GAG TGC GGC CGC ACC TAA AAC GGT GAG CTG GGT CCC-3′,scFvr2：5′-ACG GCT GCG TCA GAG TGC GGC CGC ACC TA-3′, 下划线部分为NotⅠ酶切位点．所有引物及Linker基因序列均由大连宝生物公司合成．

以合成的cDNA 为模板，VHf和VHr引物等摩尔混合扩增VH基因，Vκf/Vκr和Vλf/Vλr不同引物等物质的量混合液扩增VL基因．VL的PCR 反应条件为：95 ℃预变性10 min；94 ℃ 60 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min．VH的退火温度为65 ℃，其他反应条件同VL．PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收目的基因片段．

2.3 重叠延伸PCR 法拼接scFv

通过重叠延伸拼接法将VH和VL基因拼接成scFv基因．取纯化的VH和VL基因片段经94 ℃ 40 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，10个循环后，加含有酶切位点的引物VHf(SfiⅠ)和VLr(NotⅠ)，94 ℃ 30 s，66 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35个循环．PCR 产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收．

2.4 单链抗体克隆载体的构建

纯化的scFv经SfiⅠ和NotⅠ酶切后，与同样2 次酶切的载体pCANTAB-5E，按3∶1 的体积比，以T4 DNA 连接酶8 ℃过夜连接．以连接产物转化大肠杆菌TG1，涂于2×YT-AG平板(含100 mg/L AMP)，于30 ℃培养14～16 h，加入适量的2 ×YT 培养基刮下细菌, 取部分菌液用2 ×YT-AG稀释至A600=0.3,于37 ℃震摇1 h；加入1012个辅助噬菌体M13K07, 再摇1 h, 离心弃上清．取沉淀, 用含100 mg/L 氨苄和50 mg/L 卡那霉素的2 ×YT-AK培养基重悬后, 37 ℃摇动14～16 h，离心取上清, 加入200 g/L PEG8000 和2.5 mol/L 的NaCl 沉淀噬菌体．然后于4 ℃以10 000 r/min 离心15 min, 用2 mL 0.02 mol/L PBS(pH 7.2) 重悬沉淀, 即获抗蛔虫单链噬菌体抗体库．

2.5 抗体库的库容的测定、重组率测定和酶切鉴定

取少量菌液，用2×YT培养液以10倍梯度稀释后，涂布SOBAG平板，30 ℃培养过夜，计数平板上的噬菌斑数，计算噬菌体抗体库的库容(库容=菌落数目×涂板菌液稀释的倍数×涂布菌体体积×转化细胞总体积)；从SOBAG平板上随机挑取10 个单菌落, 进行PCR 扩增, 用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测scFv 的插入情况；提取单菌落的质粒，用SfiI、NotI 进行酶切，采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱．

2.6 抗体库的多样性分析

随机挑取VH-linker-Vκ抗体库和VH-linker-Vλ抗体库共12 个单克隆，PCR 扩增scFv基因片段，电泳回收后，用BstNⅠ酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱．

2.7 噬菌体抗体库的筛选

将蛔虫可溶性抗原以每孔100 ng 包被ELISA 板，质量分数为3%的BSA 封闭，PBS 洗涤后，加入噬菌体抗体库100 μL，37 ℃温育2 h；吸去噬菌体抗体液，以PBST 洗涤1次(第2 轮洗涤5次，第3～5 轮洗涤10 次)，PBS洗涤1次，加入100 μL 洗脱液[含0.1 mol/L HCl(pH 2)和0.1%BSA(质量分数)]，于室温静置10 min；将洗脱液稍加吹打后吸出，立即用6 μL 2 mol/L Tris 中和，加入2 mL 大肠杆菌TG1，37 ℃静置20 min；加入20 mL SOBAG，37 ℃培养2 h；加入M13K07、四环素．按2.4方法进行5 次反复淘洗，收集沉淀．特异性噬菌体抗体得到高度富集．

2.8 scFv 的可溶性表达

挑取阳性克隆加入到1 mL 2 ×YT-AG培养液中, 培养至A600=1左右，加入1010个M13K07， 于37 ℃震荡培养2 h．以3 000×g室温离心20 min， 小心去上清, 用4 mL 2×YT-AK培养基重悬细胞沉淀, 于37 ℃震荡培养过夜．再以4 000×g离心10 min，小心取上清，将滴度为1012个/L 阳性重组噬菌体, 转染入对数生长期的HB2151 细菌中, 涂于2 ×YT-AG平皿, 置30 ℃培养过夜．挑取单个菌落, 接种入5 mL 新鲜制备的SB-AG中, 30 ℃培养过夜．将5 mL 过夜培养菌加入50 mL 新鲜SB-AG中,于30 ℃震荡培养1 h．以4 000×g离心10 min, 小心去上清, 加入50 mL 2×YT-AG 含1 mmol/IPTG), 于30 ℃震荡培养4～16 h．再以8 000×g离心15 min, 取上清即为诱导表达的scFv．

2.9 表达产物的初步检测

采用竞争ELISA 法．用蛔虫可溶性抗原包被酶联板，加入鼠抗蛔虫阳性血清，于37 ℃结合1 h 后，加入系列稀释的人源scFv表达上清；另一组加入M13K07, 于37 ℃孵育1.5 h 后, 加入HRP 标记的羊抗鼠二抗进行检测．显色底物为A 液和B 液，以1 mmol/L 的硫酸终止反应后, 检测450 nm时的A值．

3 结果

3.1 人源抗体VH、VL基因和scFv片段扩增结果

扩增VH和VL基因的扩增及scFv基因的随机拼接和扩增PCR扩增出VH、VL基因, 10 g/L琼脂糖凝胶电泳分别可见VH片段长度约420 bp，VL片段长度约360 bp，与预期大小相符(图1)．VH和VL片段随机拼接成scFv片段后扩增， 10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析可见大小约750 bp的PCR扩增带，与预计结果相符(图2)．

M: DL 2000标准分子质量 (DL 2000 Marker); 1,2：VH 和VL的RT-PCR扩增产物 (RT-PCR product)图1 VH和VL基因RT-PCR扩增产物电泳分析

M: DL 2000标准分子质量 (DL 2000 Marker); 1: RT-PCR扩增产物 (RT-PCR product)图2 scFv基因PCR扩增产物电泳分析

3.2 scFv基因的酶切与连接

将纯化的scFv片段与pCANTAB5E 噬菌体载体先用限制性内切酶进行酶切，胶回收试剂盒回收酶切产物进行连接转化感染大肠杆菌TG1，随机挑选20个单克隆中有18个扩增出scFv, 基因插入率90.0%．阳性质粒做双酶切鉴定,电泳可见大小约750 bp处清晰亮带(图3) ．构建的初级抗体库经计算，库容量为1.8×106．随机挑取20个菌落，经PCR鉴定表明，克隆效率为90% (图2), 故次级库的库容量为1.6×106．

3.3 抗体库的多样性

随机挑取的10 个单克隆，经PCR 扩增scFv基因片段，电泳回收后，以BstNⅠ酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析显示，抗体库中抗体分子的多样性良好，见图4．

M: molecular marker (DL 2000 Marker); 1: 双酶切产物(Double enzyme digestion product)图3 重组质粒pCANTAB5E-scFv双酶切鉴定

M: DNA marker DL2000; 1～8: 随机挑选的单克隆图4 单克隆的BstNⅠ酶切图谱

3.4 噬菌体抗体库的筛选

将抗蛔虫噬菌体抗体库进行5 轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选．随着洗涤次数的增加，噬菌体抗体的收获率增加，经过5轮筛选增加约200倍，表明噬菌体抗体库得到富集．

3.5 人源抗蛔虫单链抗体的可溶性表达及其结合特异性分析

从富集筛选获得的scFv阳性克隆中，最后选两株阳性克隆A12 和A98 进行可溶性表达．经IPTG 诱导表达后，将培养上清直接用于竞争ELISA 检测其对蛔虫可溶性抗原的特异性和结合活性．ELISA 结果表明，该两株重组scFv均可特异性地阻断鼠抗蛔虫阳性血清与蛔虫可溶性抗原的结合，而且两者的阻断率一致；而M13K07 对鼠抗蛔虫阳性血清与蛔虫可溶性抗原的结合无阻断作用．

4 讨论

(1)抗体在疾病的诊断、治疗和预防上一直发挥着重要的作用．单链抗体(scFv)作为基因工程抗体，具有分子质量小，免疫原性低，组织穿透力强，定位迅速，清除快，易于基因工程制备和改造等[6]．因此替代常规抗体，作为诊断、治疗手段被应用于许多疾病．目前，国内外已报道了多种噬菌体抗体库的构建，并从中筛选出多株具功能活性的小分子抗体，如抗HBV、HIV、RSV、TNF、erbBZ、gpL20等单链抗体或Fab抗体山[7-10]，有些已进入了临床I/II期试验，特别是人源抗体的问世彻底解决了小分子抗体的人源化问题，极大地推动了人源抗体的研究及应用[11-15]．

(2)本研究采用噬菌体抗体库这一新兴的生物学技术，无菌取新鲜患有蛔虫病人外周血，提取中间层淋巴细胞的总RNA，以抽提的总RNA为模板反转录的cDNA，采用PCR扩增出VH片段长度约420 bp，VL片段长度约360 bp，将VH和VL片段随机拼接成scFv片段后扩增出大小约750 bp的片段，scFv片段克隆至pCANTAB5E载体，并转化至感受态TG1菌，经辅助噬菌体M13K07拯救制备抗蛔虫人源单链抗体库．本研究为抗蛔虫噬菌体展示单链抗体在蛔虫病的预防、诊断和治疗的广泛应用奠定基础．

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