丙戊酸钠对人胰腺癌细胞PaTu8988增殖的影响及量效关系研究

高飞 徐岷 麻树人 张宁 蒋小猛 徐萍

·论著·

丙戊酸钠对人胰腺癌细胞PaTu8988增殖的影响及量效关系研究

高飞 徐岷 麻树人 张宁 蒋小猛 徐萍

目的探讨丙戊酸钠(VPA)对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖和细胞周期的影响。方法应用0.2、1.0、5.0 mmol/L的VPA干预人胰腺癌PaTu8988细胞24、48 h，采用WST-8法检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞周期。以培养基中单加二甲基亚砜为空白对照组，单加PBS为PBS组。结果VPA干预24 h后，VPA 5.0 mmol/L组的细胞生长抑制率为18.9%，显著高于对照组、PBS组及VPA 0.2、1.0 mmol/L组(0、4.4%、6.8%、6.1%，P值均<0.05)；干预48 h后，VPA 1.0、5.0 mmol/L组的细胞生长抑制率分别为12.9%、25.9%，显著高于对照组、PBS组、VPA 0.2 mmol/L组(0、6.2%、4.6%，P值均<0.01)。VPA干预24 h后，VPA 1.0、5.0 mmol/L组G2期细胞比例分别为(26.57±1.88)%、(34.11±4.74)%，显著高于PBS组、对照组、VPA 0.2 mmol/L组[(10.72±2.02)%、(13.53±2.28)%、(13.81±2.40)%，P值均<0.01]；VPA干预48 h后的细胞周期变化与24 h一致。结论VPA呈时间及剂量依赖性抑制人胰腺癌PaTu8988细胞的增殖，诱导细胞阻滞在G2期。

胰腺肿瘤； 丙戊酸钠； 乙酰化作用； 细胞增殖； 细胞周期

组蛋白乙酰化在哺乳动物发育及肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用。核小体组蛋白的乙酰化状态由组蛋白乙酰化酶(histone acetyl transferase, HAT)与组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)活性的平衡所控制，这种平衡的打破成为产生某些癌症的直接诱因。丙戊酸钠(valproic acid，VPA)是一种广谱抗癫痫药物。新近研究显示，VPA也是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACI)，可诱导多种肿瘤细胞分化与凋亡[1]。它对胰腺癌细胞的作用国内尚未见报道。本研究观察VPA对人胰腺癌细胞PaTu8988增殖及细胞周期的影响，探讨其机制。

材料和方法

一、细胞培养及分组

人胰腺癌PaTu8988细胞系由德国Marburg市Philipps大学细胞生物学和分子病理学研究所Elsasser博士惠赠。收集对数生长期PaTu8988细胞，按1×104个/孔接种于96孔板。分为对照组、PBS组及VPA 0.2、1.0、5.0 mmol/L组。对照组细胞培养基中仅加入等容积二甲基亚砜，PBS组细胞培养基中仅加PBS。每组3个复孔。培养48、72 h。

二、细胞存活率检测

按上述分组培养细胞48、72 h后，每孔加入10 μl WST-8试剂(日本株式会社同仁化学研究所)，再培养4 h。在酶联免疫仪上测450 nm波长的吸光度(A450)值，参比波长为630 nm。以含等容积二甲基亚砜的培养基调零。细胞存活率= (实验孔A450值/对照孔A450值)×100%。

三、细胞周期检测

收集上述培养的各组细胞，用预冷PBS洗涤细胞2次，加入预冷70%乙醇4℃固定过夜。加入100 μg/ml的RNase 10 μl，50 μg/ml的碘化丙啶缓冲液300 μl，4℃避光孵育30 min，流式细胞仪(FACS Calibur，美国Becton Dickinson公司)检测细胞周期。

四、统计学处理

结 果

一、VPA对胰腺癌PaTu8988细胞增殖的影响

干预24 h后，对照组、PBS组及VPA 0.2、1.0、5.0 mmol/L组的A450值分别为1.000±0.023、0.956±0.070、0.932±0.101、0.939±0.089、0.811±0.131；细胞生长抑制率分别为0、4.4%、6.8%、6.1%、18.9%。VPA 5.0 mmol/L组的细胞生长抑制率显著高于其他4组(P值均<0.05)，而其他4组间的差异无统计学意义。

干预48 h后，对照组、PBS组及VPA 0.2、1.0、5.0 mmol/L组的A450值分别为2.793±0.144、2.620±0.053、2.663±0.078、2.432±0.084、2.068±0.178；细胞生长抑制率分别为0、6.2%、4.6%、12.9%、25.9%。VPA 1.0、5.0 mmol/L组的细胞生长抑制率显著高于对照组、PBS组、VPA 0.2 mmol/L组(P值均<0.01)，而VPA 0.2 mmol/L组与PBS组、对照组之间差异无统计学意义。VPA呈剂量及时间依赖性抑制PaTu8988细胞的增殖。

二、VPA对胰腺癌PaTu8988细胞周期的影响

VPA干预后，VPA 1.0、5.0 mmol/L组G1期和S期细胞比例较对照组、PBS组及VPA 0.2 mmol/L组显著减少，而G2期细胞比例显著增加(P<0.05或<0.01，表1)。

表1 VPA干预24、48 h后胰腺癌细胞PaTu8988细胞周期的变化

注：与对照组、PBS组比较，aP<0.05；bP<0.01

讨 论

表观遗传学(epigenetics)是通过DNA自身化学修饰方式从转录水平影响基因表达的，它主要包括组蛋白乙酰化修饰和DNA甲基化等[2]。核小体作为哺乳动物细胞染色质的基本组成单位，其核心由146 bp的DNA围绕一个由H2A、H2B、H3和H4各两个拷贝组蛋白构成的八聚体组成。核小体组蛋白可通过乙酰化和脱乙酰化来改变染色体的结构，也可以影响转录因子与DNA序列的结合，对基因表达调控具有类似DNA遗传密码的作用[3]。组蛋白乙酰化及去乙酰化修饰由HAT和HDAC调控，而组蛋白去乙酰化所表现的基因转录沉默与多种肿瘤的发生、发展有密切的关联[4]。HDACI能促使肿瘤细胞产生不同程度的分化、凋亡以及细胞周期的变化；可抑制肿瘤血管形成；可增强肿瘤细胞对放、化疗的敏感性[5]。所以HDACI导致的组蛋白高乙酰化状态在抗肿瘤中的作用日益受到重视[6]。

VPA类属羧酸，是一种含有8个碳原子的短链脂肪酸，目前广泛应用于抗癫痫及双相性精神障碍的临床治疗。近期研究证实，VPA是HDACs特异性抑制剂之一。据文献报道[7]，VPA在体外能够抑制血液系统和神经系统肿瘤细胞的增殖。新近研究发现[8-10]，VPA对实体性肿瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌等同样具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。但对胰腺癌细胞的作用，目前尚未见报道。

本研究结果表明，VPA干预人胰腺癌PaTu8988细胞24、48 h后，细胞生长不同程度地被抑制，抑制率在4.6%～25.9%，且呈浓度和时间依赖性，VPA 1.0、5.0 mmol/L组对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖抑制作用更显著。同时，VPA 1.0、5.0 mmol/L组的G1期及S期细胞比例明显减少，G2期细胞比例显著增多，即发生G2期细胞周期阻滞。VPA对细胞周期的阻滞作用可能由于组蛋白乙酰化及去乙酰化状态的改变导致染色质的局部重塑及DNA缠绕的核小体动态改变，从而影响了负责细胞周期调控的基因转录改变[11]。有研究表明，VPA对肿瘤细胞周期的阻滞作用主要发生在G1期，可能与p21WAF/CIPI表达增加有关。p21WAF/CIPI是体内的重要CDK抑制剂，能使Rb、p107、p130蛋白去磷酸化，抑制细胞生长，使细胞周期停滞在G1期[7]。本研究结果显示，VPA对PaTu8988细胞周期的阻滞作用主要发生在G2期。VPA对不同种类细胞周期抑制的不同，有待我们下一步深入研究。

[1] Venkataramani V,Rossner C,Iffland L,et al.Histone deacetylase inhibitor valproic acid inhibits cancer cell proliferation via down-regulation of the alzheimer amyloid precursor protein.J Biol Chem,2010,285:10678-10689.

[2] Esteller M.Epigenetics in cancer.N Engl J Med,2008,358:1148-1159.

[3] Turner BM.Cellular memory and the histone code.Cell,2002,111:285-291.

[4] 管晓翔,陈龙邦.组蛋白乙酰化修饰在基因表达调控中的作用机制.中华肿瘤防治杂志,2007,14:307-310.

[5] 储卫华,冯华.组蛋白去乙酰基酶抑制剂抗肿瘤作用的研究进展.中国肿瘤临床与康复,2008,15:186-187.

[6] Bolden JE,Peart MJ,Johnstone RW.Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors.Nat Rev Drug Discov,2006,5:769-784.

[7] Deubzer H,Busche B,Ronndahl G,et al.Novel valproic acid derivatives with potent differentiation-inducing activity in myeloid leukemia cells.Leuk Res,2006,30:1167-1175.

[8] 时昌文,李杰,赵霞，等.丙戊酸纳对肝癌细胞系HepG2的生长抑制作用.中华肿瘤防治杂志,2007,14:510-513.

[9] 赵兴海,孙京杰,刘爱武，等.丙戊酸钠调节组蛋白乙酰化抑制胃癌细胞增殖的实验研究.中华肿瘤防治杂志,2009,16:587-591.

[10] Catalano MG,Fortunati N,Pugliese M,et al.Valproic acid,a histone deacetylase inhibitor,enhances sensitivity to doxorubicin in anaplastic thyroid cancer cells.J Endocrinol,2006,191:465-472.

[11] Urnov FD,Wolffe AP.Chromatin remodeling and transcriptional activation:the cast (in order of appearance).Oncogene,2001,20:2991-3006.

2011-03-01)

(本文编辑：屠振兴)

EffectofvalproicacidontheproliferationofhumanpancreaticcancercellPaTu8988anddose-effectrelationship

GAOFei,XUMin,MAShu-ren,ZHANGNing,JIANGXiao-meng,XUPing.

DepartmentofDigestiveEndoscopy,GeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang110840,China

Correspondingauthor:MAShu-ren,Email：shuren_ma@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of valproic acid (VPA) on cell proliferation and cell cycle in human pancreatic cancer cell line PaTu8988 in vitro.MethodsPaTu8988 cells were treated with VPA in concentration of 0, 0.2, 1.0 or 5.0 mmol/L for 24 h and 48 h respectively. Cell viability was measured by WST-8 assay. Cell cycles were detected by flow cytometery. Dimethyl sulfoxide added to the medium was used as blank control group, while PBS added to the medium was used as PBS group.ResultsAfter VPA treatment for 24 h, the inhibition rate of VPA 5.0 mmol/L group was 18.9%, which was significantly higher than those in control group,PBS group and VPA 0.2, 1.0 mmol/L group (0, 4.4%, 6.8%, 6.1%,P<0.05). After 48 h, the inhibition rates of VPA 1.0, 5.0 mmol/L were 12.9%, 25.9%, which was significantly higher than those in control group, PBS group and VPA 0.2 mmol/L group (0, 6.2%, 4.6%,P<0.01). After VPA treatment for 24 h, the proportions of G2 phase cell in VPA 1.0, 5.0 mmol/L group were (26.57±1.88)%, (34.11±4.74)%, which was significantly higher than those in PBS group, control group, VPA 0.2 mmol/L group [(10.72±2.02)%, (13.53±2.28)%, (13.81±2.40)%,P<0.01], the changes 48 h after VPA treatment was consistent with the changes 24 h after VPA treatment.ConclusionsVPA may significantly suppress the cell proliferation of human pancreatic cancer cell line PaTu8988, and induce cell cycle arrest in G2 phase in a time and dose-dependent manner.

Pancreatic neoplasm; Valproic acid; Acetylation; Cell proliferation; Cell cycle

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.009

沈阳军区总医院科研基金(09Y-Z02)

110840 沈阳，沈阳军区总医院内窥镜科(高飞、麻树人、张宁)；江苏大学附属医院消化科(徐岷、蒋小猛、徐萍)

麻树人，Email:shuren_ma@163.com