γ-氨基丁酸、印防己毒素对γ δT细胞表面受体表达及对胰腺癌细胞杀伤力的影响

王营 刘世育 费素娟 陈复兴 刘军权

·短篇论著·

γ-氨基丁酸、印防己毒素对γ δT细胞表面受体表达及对胰腺癌细胞杀伤力的影响

王营 刘世育 费素娟 陈复兴 刘军权

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，不仅存在于中枢神经系统，而且广泛存在于外周神经组织及非神经组织的细胞中[1]。研究发现，CD4+和(或)CD8+T淋巴细胞上表达GABA的A受体，GABA与其结合能够抑制抗原特异性T细胞活化，具有免疫抑制作用[2]。γ δT细胞是固有免疫的一个重要细胞群，广泛分布于消化系统和呼吸系统上皮组织内,末梢血中也有一定的数量。γ δT细胞对多种肿瘤细胞系具有杀伤作用[3-4]。本实验应用GABA及其A受体拮抗剂印防己毒素(picrotoxin,PTX)诱导人γ δT细胞，观察诱导后γ δT细胞表面受体的表达和对SW1990细胞的杀伤力，探讨其机制。

一、材料与方法

1．细胞的培养：取健康献血者末梢抗凝血10 ml,加入淋巴细胞分离液，2000 r/min离心15 min，吸取单个核细胞层，生理盐水洗涤3遍后加入RPMI1640培养液(含10%小牛血清、5%人AB血清、IPP 3 ng/ml和IL-2 100 IU/ml)中常规培养。收集培养10 d的γ δT细胞。人胰腺癌细胞株SW1990购于中国科学院上海细胞生物学研究所，常规培养传代。

2．流式细胞仪检测表达表面受体γ δ-TCR和NKG2D的γ δT细胞：取培养10 d的γ δT细胞1×109个/L接种于96孔板,每孔0.2 ml 。培养24 h后分为200、800、3200 μmol/L GABA组，100 μmol/L PTX组和GABA(200 μmol/L)+PTX(100 μmol/L)组,每组分别加入荧光标记的抗人TCR -γδ-FITC单抗、抗人NKG2D-PE抗体(法国Immunotech公司)，终浓度为5 μg/ml,以不加抗体作为对照组，4℃避光孵育20 min,PBS液洗涤,然后用流式细胞仪检测。

3．LDH法检测γ δT细胞对SW1990细胞的杀伤率：将上述各组γ δT细胞与SW1990细胞数按10∶1比例混合作为测定管，同时设靶细胞自然释放管(SW1990细胞+0.5%BSA-RPMI164)及最大释放管(SW1990细胞+1%NP40),每组4个复管。常规孵育5 h后轻轻混匀细胞，再离心收集上清液，用Encore全自动生化分析仪测定LDH的活性单位(U/L)。γ δT细胞杀伤率=(测定管LDH单位-靶细胞自然释放LDH单位)/(最大释放管LDH单位-靶细胞自然释放管LDH单位)×100%。

二、结果

1．GABA及PTX对γ δT细胞表面受体表达的影响：GABA呈浓度依赖性促进γ δT细胞表面γ δ-TCR表达，PTX亦促进γ δ-TCR表达，两者联合应用进一步促进γ δ-TCR表达(P<0.05)。200 μmol/L GABA促进γ δT细胞表面NKG2D的表达，但高浓度GABA抑制NKG2D表达，PTX亦抑制NKG2D表达，两者联合应用进一步抑制NKG2D表达。3200 μmol/L GABA组显著增加γ δ-TCR和NKG2D的双表达；PTX亦可增加γ δ-TCR和NKG2D的双表达，但两种联合应用未进一步增加γ δ-TCR和NKG2D的双表达(P值<0.05或0.01，表1)。

表1 各组表达表面受体γ δ-TCR、NKG2D的γ δT细胞百分比及对SW1990细胞的杀伤率

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.05

2．GABA及PTX对γ δT细胞杀伤SW1990细胞的影响：GABA诱导后，γ δT细胞对SW1990细胞的杀伤力明显被抑制；PTX诱导后，γ δT细胞对SW1990细胞的杀伤力明显增加，与GABA联合应用，则可减轻GABA诱导所引起的抑制作用(P<0.05或<0.01，表1)。

讨论γ δ-TCR和NKG2D是γ δT细胞表达的两个主要与炎症、肿瘤等免疫相关的受体。高表达CD44的γ δT细胞更容易与肿瘤细胞黏附,有效杀伤靶细胞,这与肿瘤细胞的γ δTCR刺激物和γ δT细胞的NKG2D受体表达水平密切相关[5]。本实验结果表明，GABA及其A受体拮抗剂PTX均能促进γ δT细胞上γ δ-TCR的表达，降低NKG2D的表达，但γ δ-TCR和NKG2D双表达细胞增加，提示它们促进γ δ-TCR表达的作用强于抑制NKG2D的表达，其机制有待于进一步研究。

研究表明[6]，在一定的效靶比时γ δT细胞体外对胰腺癌细胞有巨大的杀伤活性。本结果显示，GABA可以抑制γ δT细胞对SW1990细胞的杀伤力，并呈剂量依赖性，与NKG2D表达降低程度呈正相关；而PTX可促进γ δT细胞对肿瘤细胞的杀伤力，提示γ δT细胞杀伤癌细胞主要是通过其表面受体NKG2D介导的。

[1] Watanabe M, Maemura K, Kanbara K,et al. GABA and GABA receptors in the central nervous system and other organs. Int Rev Cytol,2002, 213:1-47.

[2] Alam S, Laughton DL，Walding A, et al. Wolstenholme. Human peripheral blood mononuclear cells express GABAA receptor subunits. Mol Immunol，2006，43：1432-1442.

[3] 陈复兴，刘军权，冯霞，等.人末梢血γδT细胞对消化系统肿瘤细胞的杀伤作用.世界华人消化杂志,2007,15：111-116.

[4] Kabelitz D, Wesch D, He W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.Cancer Res,2007,67:5-8.

[5] Corvaisier M, Moreau Aubry A, Diez E,et al. V gamma 9V delta 2 T cell response to colon carcinoma cells. J Immunol,2005, 175: 5481-5488.

[6] 戴梦华, 何维, 赵玉沛. 外周血αβT和γδT细胞对胰腺癌细胞株的杀伤作用.中华肝胆外科杂志.2006, 12：440-443.

2010-09-15)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.022

徐州市科技局科技计划项目(XZZD0818)

江苏省徐州医学院附属医院消化科(王营、费素娟)；江苏省徐州市第一人民医院消化科(刘世育)；中国人民解放军第九七医院实验科(陈复兴、刘军权)

王营，Email:wangyingxu20@21cn.com