髓样细胞表达激发受体-1对急性坏死性胰腺炎大鼠继发感染的判断价值

袁伟红 徐岷 张尤历 路筝 曹亮 李兆申

·论著·

髓样细胞表达激发受体-1对急性坏死性胰腺炎大鼠继发感染的判断价值

袁伟红 徐岷 张尤历 路筝 曹亮 李兆申

目的探讨髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)在急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠继发感染早期的表达变化及其判断价值。方法24只雄性SD大鼠按数字表法随机分为对照组、ANP组、ANP继发感染 (SI)组。通过腹腔注射L-精氨酸、大肠杆菌建模。制模后24 h取血和腹水行细菌培养，测血清淀粉酶、C-反应蛋白(CRP)、TNF-α及TREM-1水平，胰腺组织常规病理检查，实时PCR和蛋白质印迹法检测胰腺组织TREM-1 mRNA和蛋白的表达。结果ANP组和SI组的胰腺病理评分、血清淀粉酶水平均明显高于对照组，且SI组血和腹水细菌培养阳性率达100%，表明制模成功。SI组血CRP、TNF-α水平分别为(18.7±3.1)mg/L和(185.7±10.9)mg/L，与ANP组的(16.5±3.6)、(176.0±18.6)mg/L无显著差异。SI组的血清TREM-1水平、胰腺组织TREM-1 mRNA及蛋白表达量分别为(9.3±0.9)ng/ml、14.84±3.45、316.2±59.2，均显著高于ANP组的(5.5±0.3)ng/ml、4.51±1.44、188.6±42.4(P值均<0.05)。结论血清TREM-1水平对急性胰腺炎继发感染早期具有一定的判断价值。

胰腺炎，急性坏死性； 髓样细胞表达激发受体-1； 继发感染

目前普遍认为，继发感染是引起重症急性胰腺炎(SAP)后期高病死率的主要原因之一。现临床已通过C-反应蛋白(CRP)和TNF-α等来评判感染，但早期诊断价值非常有限。因此临床急需找到敏感、特异、能即时反映感染过程的指标，以监测疾病进展，指导抗生素的应用。髓样细胞表达激发受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)是在炎性反应触发及放大过程中具有重要作用的一种蛋白。本实验通过建立大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)及其继发感染模型，检测血清及胰腺组织TREM-1的表达，探讨TREM-1对胰腺炎继发感染的早期诊断价值。

材料和方法

一、实验动物及分组

雄性SD大鼠24只，体重160～180 g，清洁级，购自浙江省实验动物中心。按数字表法随机分为对照组、ANP组、ANP继发感染组(SI组)。采用20% L-精氨酸(国药化学试剂有限公司)腹腔注射2.5 g/kg体重、共2次、间隔1 h的方法制备ANP模型。对照组腹腔注射等容积生理盐水。SI组于末次L-精氨酸注射3 h后腹腔注射大肠杆菌DH5α 1.5 ml (菌液浓度约为108/ml),ANP组和对照组同时点注射等容积生理盐水。术后24 h，剖腹取腹水及血行细菌培养，无腹水者采用3 ml无菌生理盐水冲洗腹腔后收集冲洗液。另留取血清-20℃保存；取大鼠胰腺组织，部分用10%中性甲醛固定，部分置液氮冻存。

二、血清淀粉酶、TNF-α、CRP、TREM-1水平检测

血清淀粉酶活性采用全自动生化分析仪测定。血清CRP、TNF-α及TREM-1采用ELISA方法检测。TNF-α、CRP的ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司，TREM-1的ELISA检测试剂盒购自美国GBD公司。按说明书操作。

三、胰腺组织病理学检查

胰腺组织常规病理检查。每张切片选取10个高倍镜视野，参考Rongione等[1]标准从水肿、炎症、出血、坏死4项进行评分，各项评分之和为最终得分。

四、实时PCR检测胰腺组织TREM-1 mRNA表达

胰腺组织液氮研磨，采用Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取总RNA。采用Fermentas反转录试剂盒(立陶宛Fermentas公司)进行反转录。在美国Mx3000P Real-time PCR扩增仪进行扩增。依据NCBI公布的序列设计引物。TREM-1上游引物5′-GGTGACCAAGGGTTCTTC-3′，下游引物5′-GTA-TGTGGAGACACTCGTAG-3′，扩增片段196 bp；内参β-actin上游引物5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAAC-ACAGT-3′，下游引物5′-GACAGTGAGGCCAGGATA-GAG-3′，扩增片段182 bp。PCR反应条件：95℃ 20 s，58℃ 30 s，72℃ 15 s，40个循环。每个样品重复检测3次，采用相对定量法分析数据，将对照组表达量设为1，根据2-ΔΔCt公式计算基因相对表达倍数。

五、蛋白质印迹法检测胰腺组织TREM-1蛋白表达

提取组织蛋白，常规行蛋白质印迹法。羊抗大鼠TREM-1抗体(Santa Cruz公司)1∶100稀释，辣根过氧化物酶偶联兔抗羊IgG抗体1∶5000稀释，小鼠抗大鼠β-actin1∶500稀释，辣根过氧化物酶耦联山羊抗小鼠IgG抗体1∶4000稀释。最后用ECL显色。

六、统计学处理

结 果

一、胰腺组织病理变化

对照组大鼠胰腺无明显改变。ANP组大鼠胰腺组织出血坏死，部分见血性腹水，光镜示胰腺小叶轮廓破坏，间质水肿，血管充血，中性粒细胞和单核细胞浸润。SI组大鼠胰腺组织可有皂化，伴大量血性腹水，肠管肿胀，光镜示胰腺组织水肿、炎症浸润程度较ANP组严重，腺泡小叶结构明显破坏，片状脂肪坏死和出血。对照组、ANP组、SI组病理评分依次增加，各组间差异具有统计学意义(P值均<0.05，表1)。

二、血和腹水细菌培养结果

每只大鼠血和腹水的细菌培养结果一致。对照组均未培养出细菌；ANP组细菌阳性率为12.5%(1/8)，菌落克隆数量较少；SI组阳性率为100%(8/8)，菌落克隆数量多。培养的阳性菌种均为大肠杆菌。

三、血清淀粉酶、CRP、TNF-α及TREM-1水平变化

ANP组和SI组的血清淀粉酶、CRP、TNF-α及TREM-1水平均显著高于对照组。SI组血淀粉酶、TREM-1水平较ANP组显著升高(P值均<0.05)，而血CRP、TNF-α水平与ANP组无显著差异(表1)。

表1 各组血清淀粉酶、CRP、TNF-α、TREM-1水平变化及胰腺病理评分

注：与对照组比较，aP<0.05；与ANP组比较，bP<0.05

四、胰腺组织 TREM-1mRNA和蛋白表达变化

对照组、ANP组、SI组大鼠胰腺组织TREM-1 mRNA表达量分别为1.00、4.51±1.44、14.84±3.45，三组间差异均具有统计学意义(P值均<0.05)；TREM-1蛋白相对表达量分别为153.7±26.6、188.6±42.4、316.2±59.2，SI组较对照组及ANP组显著增加(P值均<0.05，图1)。

图1各组胰腺组织TREM-1蛋白的表达(蛋白质印迹法)

讨 论

TREM是Bouchon等[2]于2000年首次发现的表达于人类髓系细胞的一种活性受体，属于免疫球蛋白超家族成员。当机体继发感染时，TREM-1与其配体结合，促使单核细胞分泌炎性细胞因子，促使单核细胞和中性粒细胞表面多种细胞黏附分子表达增多，从而加快单核细胞和中性粒细胞向炎症部位的迁移；并使包括CD40、CD86、CD54在内的共刺激分子以及单核细胞表面的CD83和CD32的表达大幅度增加，触发及扩大细菌感染后细胞因子的级联反应。因此TREM-1被认为在机体的急性过度炎症反应过程中起着重要作用[3]。

本结果显示，ANP组和SI组CRP、TNF-α及TREM-1水平均显著高于对照组，但两组间CRP、TNF-α水平无显著差异，而SI组的TREM-1水平显著高于ANP组。表明CRP、TNF-α在判断早期继发感染中的应用价值有限。进一步通过实时PCR和蛋白质印迹法证实SI组大鼠胰腺组织TREM-1mRNA和蛋白的表达量均显著高于对照组，同时亦显著高于ANP组，提示ANP早期继发感染时TREM-1在mRNA及蛋白层面都有高表达，与Gibot等[4]、Yasuda等[5]、Kamei等[6]的结果一致，表明TREM-1对胰腺炎及其早期继发感染具有一定的判断价值，可能对抗生素的合理使用及手术时机的选择具有一定的指导意义。

[1] Rongione AJ, Kusske AM, Kwan K, et al. Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in rat. Gastroenterology, 1997, 112:960-967.

[2] Bouchon A,Dietrich J,Colonna M.Cutting edge:inflammatory responses can be triggered by TREM-1,a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes.J Immunol,2000,164:4991-4995.

[3] Tang BM, Eslick GD, Craig JC, et al. Accuracy of procalcitonin for sepsis diagnosis in critically ill patients：systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis, 2007, 7:210-217.

[4] Gibot S, Cravoisy A, Kolopp-Sarda MN, et al. Time-course of sTREM(soluble triggering receptor expressed on myeloid cells)-1, procalcitonin, and C-reactive protein plasma concentrations during sepsis. Crit Care Med, 2005, 33:792-796.

[5] Yasuda T, Takeyama Y, Ueda T, et al. Increased levels of soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in patients with acute panereatitis. Crit Care Med, 2008, 36:2048-2053.

[6] Kamei K, Yasuda T, Ueda T, et al. Role of triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in experimental severe acute pancreatitis. J Hepatobiliary Pancreat Sci, 2010, 17:305-312.

2011-02-12)

(本文编辑：吕芳萍)

DiagnosticvalueofTREM-1insecondaryinfectionofacutenecrotizingpancreatitisofrat

YUANWei-hong,XUMin,ZHANGYou-li,LUZheng,CAOLiang,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China

Correspondingauthor:ZHANGYou-li,Email:zjyouli@yahoo.com.cn

ObjectiveTo detect the expression of triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1) in the early secondary infection of acute necrotizing pancreatitis (ANP) and to probe its diagnostic value for early infection.MethodsTwenty-four male SD rats were randomly divided into the control (C) group, the ANP group and the secondary infection of ANP (SIANP) group. The constructions of the models were achieved through intraperitoneal injection of L-arginine and E.coli. After 24 hours, the blood and peritoneal fluid samples were collected for bacterial culture, and the serum levels of amylase, CRP, TNF-α and TREM-1 were detected. The pathological changes in the pancreas were observed. The expression of TREM-1 mRNA and TREM-1 protein in pancreatic tissue was detected by Real-time PCR and Western Blot.ResultsThe histological score of pancreas, and serum amylase in ANP group and SIANP group were significantly higher than those in C group; the positive rate of bacterial culture of blood and peritoneal fluid in SIANP group was 100%, which suggested the model was successfully established. CRP and TNF-α levels in SIANP group were (8.7±3.1)mg/L and (185.7±10.9)mg/L, which were not significantly different from that in ANP group [(16.5±3.6), (176.0±18.6)mg/L]. The serum level of TREM-1, expression of TREM-1 mRNA and TREM-1 protein in pancreatic tissue was (9.3±0.9)ng/ml,14.84±3.45, 316.2±59.2, which were significantly higher than those in ANP group [(5.5±0.3)ng/ml, 4.51±1.44, 188.6±42.4,P<0.05].ConclusionsTREM-1 has diagnostic value for early secondary infection of ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Triggering receptor expressed on myeloid cells-1; Secondary infection

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.016

江苏省自然科学基金(BK2009211)

212001 镇江，江苏镇江江苏大学附属医院消化科(袁伟红、徐岷、张尤历、曹亮)；第二军医大学长海医院消化科(路筝、李兆申)

张尤历，Email:zjyouli@yahoo.com.cn